ゲノム改変ニコチアナ・ベンサミアナにおけるモノテルペンインドールアルカロイド生合成の再構成

Communications Biology volume 5、記事番号: 949 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

モノテルペンインドールアルカロイド (MIA) は、多数の薬学的に重要な化合物を含む、多様な種類の植物天然産物です。私たちは、ベンサミアナタバコの中枢代謝から、すべての MIA の重要な中間体であるストリクトシジンの経路を再構成することに着手しました。この宿主の欠点は、その豊富なバックグラウンド代謝により、異種的に生成された一部の分子が誘導体化されることです。今回我々は、トランスクリプトーム解析を用いて、生合成中間体に応答して上方制御されるグリコシルトランスフェラーゼを同定し、それらをコードする遺伝子に標的変異を有する植物株を作出する。これらの系統における初期 MIA 経路の発現により、より好ましい製品プロファイルが生成されます。ストリクトシジン生合成は、14 種類の酵素の共発現によって最良の収率が得られ、再構成に成功しました。このうち、Nepeta (キャットミント) 由来の主要なラテックスタンパク質様酵素 (MLPL) は、イリドイド経路を通るフラックスの改善に重要です。内因性グリコシルトランスフェラーゼの除去はストリクトシジンの収量に影響を与えず、安定な生合成中間体への経路酵素の代謝フラックスにより、宿主の内因性代謝を操作する必要性が最小限に抑えられることが強調されます。植物におけるストリクトシジンの生産により、生物学的合成に適した MIA 製品の範囲が広がります。

合成生物学のアプローチを植物システムのエンジニアリングに適用することで、生合成経路の制御と発現の進歩が促進され、植物が代替の生化学生産シャーシとして機能できるようになりました 1,2。タバコの近縁種である N. ベンタミアナ 3,4 は、植物ベースの医薬タンパク質の生産 5 や代謝経路の再構成 2 に適した種として浮上しています。成功には、トリテルペノイドのグラムスケールの生産 6 やエトポシドのミリグラムスケールの生産 7 が含まれます。しかし、いくつかの研究では、おそらくオキシダーゼやグリコシルトランスフェラーゼなどの内在性ベンサミアナ酵素のオフターゲット活性によって生成される、意図しない副産物の蓄積が報告されています8、9、10、11、12、13、14、15、16、17。、18．一部の研究では、内因性酵素の活性を利用して、新規分子 9 を生成したり、既知の酵素の欠如を補ったり 19 していますが、ほとんどの場合、分子の誘導体化が欠点であり、標的化合物の潜在的な純度と収率が低下します。

モノテルペンインドールアルカロイド (MIA) は、植物が生成する天然産物の大きなグループであり、そのうち 3,000 種類以上が確認されています 20。このクラスの分子には、中毒、心臓病、認知症、痛み、癌、マラリア、糖尿病の治療に使用される多くの薬学的に価値のある化合物が含まれています。最もよく特徴づけられている MIA 生成植物はニチニチソウ (マダガスカルツルニチニチソウ) で、化学療法として使用される生理活性ビンブラスチンやビンクリスチンを含む 130 を超える MIA を生成します。しかし、これらの貴重な分子は C.roseus 中に低濃度で存在し (乾燥重量 0.0005%)21、その入手可能性が制限されています。 C. ロゼウス細胞の大量培養は実現可能ですが、これらの抗がん分子を一貫して産生する細胞株はまだ報告されていません 22。 C. ロゼウス植物の一過性発現 23 および安定した遺伝子形質転換 24 の方法は報告されていますが、天然植物宿主を遺伝子操作してこれらの化合物の収量を増加させることは依然として技術的に困難です。さらに、多くの MIA は構造が複雑であるため、化学合成が困難な場合が多い 25,26。したがって、代替の生産経路が望ましく、ビンブラスチン経路の欠落しているステップが最近発見された 27,28 ことにより、異種宿主における経路の再構築はますます魅力的な選択肢となっている。

治療上有用な量の MIA の生成を達成するには、経路の初期部分を通る代謝フラックスを最大化する経路工学が必要です。ストリクトシジンは、3000 以上の既知の MIA のすべてが由来する最後の一般的な生合成中間体です。微生物における約 11 段階の生合成経路の再構成には、酵素発現条件の広範な調整と菌株の最適化が必要となる場合があります 29。たとえば、ゲラニオール 8-ヒドロキシラーゼ (G8H) の発現不良により、酵母におけるストリクトシジン生産が妨げられています 30。ストリクトシジンを超えるさらに 16 種類以上の酵素の発現を必要とするビンブラスチンなどの分子を有用な収量で得るには、かなりの工学的操作が必要になる可能性がありますが、酵母は最近、29 の発現カセットのゲノム統合を介してアジマリシンを生成するように操作されており、植物天然産物生合成経路の異種再構築の可能性の取り組み31。

酵母は代謝経路の異種発現にとって有望な宿主であり続けますが、植物由来タンパク質は植物宿主での発現を成功させるために必要な最適化や操作が少なくて済むことがよくあります。 Miettinen らは N. benthamiana での発現を利用して C.roseus イリドイド経路を再構成し、経路の残りの 4 つの欠落ステップの解明を可能にしました 26。しかし、彼らは 13 段階の経路の途中で代謝のボトルネックに遭遇し、2 段階での再構成が必要となり、後半ではストリクトシジンを得るために中間基質 (イリドトリアル) の提供が必要となりました 27。さらに、N. ベンタミアナの豊富な内因性代謝は、ストリクトシジン生合成の初期の疎水性中間体に作用して、さまざまな誘導体化された最終生成物を生成しました。

今回我々は、N.ベンサミアナにおけるストリクトシジンの新規生産に成功しました。我々は、経路の初期中間体を誘導体化する内因性グリコシルトランスフェラーゼを同定し、これらの酵素をコードする遺伝子に機能喪失型変異を有する植物系統では誘導体の蓄積が少ないことを実証した。我々は、ネペタラクトールの産生を強化し、代謝物前駆体や中間体の補充を必要とせずに、N. ベンタミアナの中心代謝から高レベルのストリクトシジンを産生できるようにする追加の遺伝子を利用します。全体として、この研究は、小分子の生物生産シャーシとしての N. benthamiana の可能性を実証しています。

ストリクトシジンはテルペノイドのセコロガニンに由来します。セコロガニンは、ゲラニオールの酸化、還元環化および実質的な誘導体化から誘導されるモノテルペンのイリドイドクラスに属します。形成後、セコロガニンはトリプタミンと縮合および環化してストリクトシジンを形成します。 N. ベンサミアナにおける低分子量テルペノイド生合成経路の異種発現を目的とした以前の研究では、誘導体化された生合成中間体の蓄積が報告されています 29。イリドイド経路の初期段階における誘導体化を調査するために、シス-トランスネペタラクトールまでの経路段階をコードするプラスミドを含むA. ツメファシエンス株とN. ベンサミアナを共浸潤させることにより、初期ストリクトシジン経路酵素を一時的に発現させました（図1）。色素体 2-C-メチル-D-エリスリトール 4-リン酸/1-デオキシ-D-キシルロース 5-リン酸 (MEP/DOXP) 経路からのゲラニオールピロリン酸 (GPP) 基質のプールを強化するために、二官能性ゲラニル/ Picea abies 由来のゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ (PaGPPS) および C. Roseus 由来の 1-デオキシ-D-キシルロース 5-リン酸シンターゼ (DXS) (CrDXS) で、どちらも色素体を標的とします。ゲラニオールを生成するために、これらは、植物におけるゲラニオールの異種生成を可能にすることが以前に示されている C. ロゼウス由来のゲラニオールシンターゼ (CrGES) と共発現されました 32。次に、最初の 3 つの専用ストリクトシジン経路ステップ、ゲラニオール 8-オキシダーゼ (CrG8H)、8-ヒドロキシゲラニオールオキシドレダクターゼ (CrGOR)、およびイリドイドシンターゼ (CrISY) を追加して、シス-トランスネペタラクトールを生成し、一過性に感染した N の高分解能質量分析を実行しました。ベンタミアナの葉を調べて酵素産物を特定します。 Dong ら 32 が報告したように、CrDXS、PaGPPS、CrGES の一過性発現により、ゲラニオールの不揮発性グリコシル化および酸化誘導体が生成されることがわかりました (図 1 および補足表 1)。シス-トランスネペタラクトールまでの後の経路ステップを追加すると、誘導体化生成物のプロファイルがさらに変更されました。一般に、追加される経路ステップが増えるにつれて蓄積される誘導体は少なくなり、強力な構成的発現によって経路酵素が内因性基質と競合できることが示唆されました（図1）。

一般的な修飾は、ペントースおよびヘキソース糖の追加でした。たとえば、ピーク 1、ヘキソシルヒドロキシゲラニオール [M + HCOOH-H]、3.84 分、m/z 377.1817。ピーク 2、ヘキソシルヒドロキシシトロネラール [M + HCOOH-H]、4.12 分、m/z 379.1974; ピーク 3、トリヘキソシルゲラン酸 [M + HCOOH-H]、4.35 分、m/z 699.2703)。ピーク 4、ペントシルヘキソシルゲラニオール [M + HCOOH-H]、5.32 分、m/z 493.2288; ピーク 5、アセチルジヘキソシルゲラニオール [MH]、5.454 分、m/z 519.2445; DXS、1-デオキシ-D-キシルロース 5-リン酸シンターゼ。 GPPS、ゲラニル二リン酸シンターゼ。 GES、ゲラニオール合成酵素。 G8H、ゲラニオール 8-オキシダーゼ。 GOR、8-ヒドロキシゲラニオール酸化還元酵素。 ISY、イリドイドシンターゼ。

誘導体化の共通の特徴の 1 つは、ペントースとヘキソースの糖の追加でした。モノテルペンを含む植物天然産物のグリコシル化に主に関与する酵素は、グリコシルトランスフェラーゼファミリー 133 に属します。我々は、これらの UGT の多くが、防御などに使用される内因性二次代謝産物の生合成に関与している可能性が高いと仮説を立てました。あるいは、これらの UGT はさまざまな代謝産物の解毒に関与している可能性があります。したがって、機能喪失変異をコードする遺伝子に機能喪失変異を導入しても、アグロインフィルトレーションに使用される制御された環境で栽培される植物の発育に大きな影響を与える可能性は低いと考えました。しかし、すべての維管束植物のゲノムから適切な相同体を検索することで多数の UGT を容易に同定できますが、基質特異性を予測し、特定の代謝産物の修飾に関与する個々の遺伝子を同定することは困難です 34。

遺伝子発現の変化が観察された化学修飾と相関しているかどうかを調べるために、イリドイド経路が浸潤した葉サンプルのトランスクリプトーム分析を実施しました。アグロインフィルトレーションに対する実質的な転写応答は以前に観察されているため 35、非浸潤対照植物と構成的に発現する緑色蛍光タンパク質 (GFP) を浸潤させた対照植物の両方に対する発現の変化を比較しました (方法を参照)。我々は、一部の UGT の発現が浸潤に応答して増加する一方、他の UGT はゲラニオールまたはネペタラクトールへの経路の発現に特異的に応答して増加することを観察しました (補足表 2)。また、N. ベンサミアナの葉トランスクリプトームで同定されたすべてのファミリー 1 UGT の系統解析を実行し (方法を参照)、シロイヌナズナで見つかった UGT およびゲラニオールおよびネペタラクトール基質に対して活性であることが知られている以前に特徴付けられた植物 UGT との関係を調査しました (図.2および補足図1)。

グループ AP には、Caputi らによって使用された命名法に従って注釈が付けられます。標識された分類群は、Cas9 媒介の標的変異がその後導入された酵素を示します。ノードの黒く塗りつぶされた灰色の円は、ブートストラップサポートが 95 以上であることを示します。スケールバーは、部位ごとの置換数を表します。すべての分類群とブートストラップ値を含むツリーを補足図 1 に示します。

私たちは、N. ベンタミアナのシャーシを改善する 1 つの方法は、これらの内因性 UGT をコードする遺伝子に変異を導入することによってそれらを除去することであると仮説を立てました。発現プロファイルと予測された基質選択性の両方を使用して、Cas9 媒介標的突然変異誘発の遺伝子標的を選択しました。次に、合計 25 の UGT をターゲットとする 8 つのプラスミドを構築しました (表 1)。まず、野生型 N. ベンタミアナ植物の安定した形質転換のための 3 つのバイナリーベクター (pEPQDPKN0720、pEPQDPKN0724、pEPQDPKN0361) を設計しました (補足図 2-4)。これらのコンストラクトは、ゲラニオールに対して活性であることが以前に示されているグループ D、E、および G の UGT をコードする遺伝子を標的とする sgRNA をコードし 36、37 に加え、同じ基質上で活性を示す可能性があるという論理を備えた同じグループの特徴づけられていない UGT もコードしました (表 1 および G)。補足表 3)。各構築物が標的とするUGTは密接に関連しているため、一部のsgRNAは複数の遺伝子を標的にすることができました。その結果、各構築物は、4つのグループD UGT、5つのグループE UGT、または3つのグループG UGTのいずれかの最初または2番目のエクソンを標的とする6つのsgRNAをコードしました（表1および補足図2〜4）。これらの構築物を野生型植物に送達し、再生されたトランスジェニック (T0) 植物の遺伝子型を決定しました。遺伝子型が不明瞭であるか、潜在的な遺伝的キメラ現象を示している系統を廃棄し、標的位置にホモ接合性、ヘテロ接合性、または両対立遺伝子変異がある系統を選択しました。 T1 植物では、T-DNA の有無とともに遺伝子型が確認されました。 18 個の sgRNA はすべて、少なくとも 1 つの T0 植物に変異を導入しました。特に、NbUGT72B58 と NbUGT72B35 の両方にフレームシフト変異を持つ植物を回収することはできませんでしたが、他のグループ E の UGT と組み合わせて、これらの遺伝子のそれぞれに変異を持つ系統を回収することができました (表 1)。 12 個の個別の遺伝子の異なる組み合わせに変異を持つ 6 つの T1 植物を選択しました (表 1)。すべての系統は形態学的に正常であり、成長および発育において明らかな変化はなく、対照系統と同時に成熟した。

また、Ellison らによって以前に記載された方法を使用して、モバイル sgRNA をコードする 5 つの TMV ベースのウイルスベクターを設計および構築しました 38。 4 つのベクターには、浸潤後に強く上方制御される (pEPQDKN0777)、ゲラニオール経路 (pEPQDKN0778) またはネペタラクトール経路の発現に応答して強く上方制御される (pEPQDKN0779)、またはネペタラクトール経路の発現後に高い正規化カウントを有する UGT を標的とする可動性 sgRNA が含まれていました ( pEPQDKN0780) (表 1、補足図 5、および補足表 2)。最終的なベクターは、ゲラニオール 37 に対して活性であることが知られている 4 つの UGT を標的とする 3 つの可動 sgRNA をコードしました (pEPQDKN0781) (表 1、補足図 5 および補足表 3)。これらのベクターを、Cas9 を構成的に発現するトランスジェニック植物に浸潤させました。子孫種子 (E1 と指定) は、標的部位で突然変異が検出された茎上に形成された莢から収集されました (方法を参照)。 E1 植物の遺伝子型を分析し、標的位置にホモ接合性、ヘテロ接合性、または両対立遺伝子変異がある系統を再度選択しました。全体として、モバイル sgRNA メソッドは効率が低く、15 個のモバイル sgRNA のうち 8 個でターゲットに変異が導入されました。これにより、それぞれ 1 つ、2 つ、または 3 つの標的 UGT に変異がある 5 つの E1 系統が選択されました (表 1 および補足図 5)。上記のように、成長や発達に変化はありませんでした。

UGTに変異を導入するとゲラニオール誘導体の存在が減少するかどうかを調べるために、すべての標的遺伝子座の遺伝子型が確認されている変異植物に、ゲラニオールまたはシス-トランスネペタラクトールを生成する経路酵素をコードするアグロバクテリウム株を浸潤させた。前述したように、UHPLC/MS によってサンプルの誘導体を分析し、代謝プロファイルを親株 (野生型および Cas9 トランスジェニック株)、および組織培養で再生および増殖させた非トランスジェニック、非変異対照株の子孫と比較しました。同じ条件で。

グループA UGT、NbUGT94E7に変異を持つ植物は、ゲラニオールまたはネペタラクトールのいずれかを生成する経路酵素の発現後にトリヘキソシルゲラン酸（m/z 699.2713、[M + HCOOH-H]）を蓄積しませんでした（図3、補足データ1）、補足図6および7）。ネペタラクトールを生成する経路酵素が発現されたサンプルでは、アセチルジヘキソシルゲラニオール (m/z 519.2445、[MH]) の存在も除去されました。さらに、グループ G の NbUGT85 A73 に変異を持つ 3 系統と、NbUGT72AY1 (グループ E) または NbUGT85A74 および NbUGT85A104 (グループ G) のいずれかを組み合わせた場合、ヘキソシルヒドロキシゲラニオールの蓄積が少ないかまったく蓄積されませんでした (m/z 377.1817、[M + HCOOH-H]) 、ヘキソシルヒドロキシシトロネラール (m/z 379.1974、[M + HCOOH-H])、ペントシルヘキソシルゲラニオール (m/z 493.2288、[M + HCOOH-H])、またはアセチルジヘキソシルゲラニオール (m/z 519.2445、[MH]) (図 3、補足データ 1、補足図 6 および 7)。興味深いことに、これらのピークは、ネペタラクトールを生成する経路酵素が発現されたサンプルにのみ存在しませんでした。

ピーク 1 ～ 5 の割り当てられたアイデンティティを図 1 に示します。星印は、ゲラニオールに対する活性が以前に報告されていることを示します。値およびエラーバーは、n = 3 の生物学的複製の平均および標準誤差を表します。すべての変異株と 3 つの対照株すべて (灰色のバー) のペアごとの比較では、ポストホック Tukey HSD を使用した一元配置分散分析によって、共通のギリシャ文字 (α、β、γ、δ) が続く平均値に大きな違いはありません。 5%の有意水準で。ギリシャ文字の値を持たないプロットには、3 つの対照線と有意な差がある実験線がありません。

次に、中心のストリクトシジン中間体までの経路を再構成することを目的として、イリドイド経路の延長に焦点を当てました。以前に報告された試みでは、ストリクトシジンを得るためにイリドトリアルの浸潤を必要とする代謝ボトルネックに遭遇しました38。ネペタ属におけるシス-トランスネペタラクトン生成の生合成経路は、C. ロセウスから NADPH 依存性イリドイド合成酵素 (ISY) による 8-オキソゲラニアルのエノール中間体への立体選択的還元までのセコイリドイド経路と共通しています 39。最近、ネペタでは、ISY がネペタラクトール関連短鎖デヒドロゲナーゼ還元酵素 (NEPS) または主要なラテックスタンパク質様酵素 (MLPL) と組み合わせて機能し、閉環の立体選択性を制御することが示されました 40,41。したがって、我々は、ストリクトシジンに見られる立体化学に特異的なネペタムッシーニ（別名ネペタラセモサ）由来の MLPL を添加すると、N. ベンサミアナの経路を通るフラックスが強化されるのではないかと仮説を立てました。酵母 31 および無細胞 42 系での再構成に関する最近の取り組みでも、この酵素が収量を大幅に向上させることが示されています。

MLPL を使用せずに 7-DLA を生成するすべての経路酵素の浸潤は、以前の報告と一致して、7-DLA (予想 m/z 359.1349) またはアシル化 7-DLA (予想 m/z 401.1447) のピークを生成しませんでした 39 (図 4)。。ただし、MLPL を含めると、7-DLA 標準の保持時間と一致する m/z 359.1342 の明確なピークが生成されました。 7-デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ (7-DLGT) を除外すると、同じ m/z のピークが生成されますが、これは 7-DLA の保持時間と一致しません。内因性 UGT が 7-デオキシロガン酸を使用してグルコースエステルを生成できる可能性があります。初期経路で観察されたように、経路遺伝子 (この場合は 7-DLGT) の強力な構成的発現が天然酵素を打ち負かす可能性があり、その結果、完全な 7-DLA 経路のスペクトルにこの推定上のグルコースエステルピークが存在しません。

すべての経路酵素と MLPL の一過性発現により、7-デオキシロガン酸 (7-DLA) 標準の質量と保持時間に一致する 359.1342 m/z のピークが生成されます。 DLGT を使用せずに再構成された経路でも 359.1343 m/z ピークが生成されますが、保持時間は異なります。これは、おそらく 7-デオキシロガン酸のグルコースエステルを生成する N. ベンサミアナの内因性グリコシルトランスフェラーゼによるものです。 DXS、1-デオキシ-D-キシルロース 5-リン酸シンターゼ。 GPPS、ゲラニル二リン酸シンターゼ。 GES、ゲラニオール合成酵素。 G8H、ゲラニオール 8-オキシダーゼ。 GOR、8-ヒドロキシゲラニオール酸化還元酵素。 ISY、イリドイドシンターゼ。 MLPL、主要なラテックスタンパク質様。 IO、イリドイドオキシダーゼ。 7-DLGT、7-デオキシロガン酸グルコシルトランスフェラーゼ。

7-DLAの生成に成功した実験条件に基づいて、残りの5つの経路酵素を順次追加し、各遺伝子を順次追加した後の経路中間体を測定しました（図5a、補足データ1、補足図8〜12）。経路全体の酵素を発現する株の共浸潤により、ストリクトシジン標準に一致する531 m/zで明確なピークが生成されます（図5b、c、補足データ1、補足図11）。この経路構成は 4.29 ± 2.00 μM のストリクトシジンを生成します。これは、0.23 ± 0.11 mg ストリクトシジン/乾燥重量葉組織 g (0.023% DW) に相当します。蓄積が観察された唯一の主要な生合成中間体はロガニンであり、セコロガニン合成酵素がボトルネックステップであることを示唆しています。これは、基質親和性が低い（Km = 12.5 ～ 14.8 mM）43,44 ロガン酸 O-メチルトランスフェラーゼ (LAMT) がセコイリドイド経路の後期段階の律速段階である可能性を示唆する以前のデータとは対照的です。ストリクトシジンに加えて、全経路の一過性発現により、ストリクトシジンから86 Daの質量シフトを持つ少量の化合物（図5c、補足図11）も生成され、これは生成されたストリクトシジンのマロニル化誘導体である可能性があることを示唆しています内因性N.ベンタミアナアシルトランスフェラーゼによる。 GPPSおよびMLPLを使用しないストリクトシジン経路の一過性発現(図5b、補足データ1)は、ストリクトシジン収量に対するこれらの酵素の有益な効果を確認する。 MLPL の添加によりストリクトシジンの生産が 60 倍を超えて増加しましたが、GPPS の補充により収率が約 5 倍向上しました。 DXS の補給により、生成されるストリクトシジンの量は変化しませんでした (図 1)。

a UPLC/MS 分析による中間体および最終生成物ストリクトシジンの定量。 b MLPL が存在しないとストリクトシジンの生成が 60 倍を超えて減少しますが、GPPS を補充すると収量が約 5 倍向上します。 c ストリクトシジンへの経路全体（DXS、GPPS、およびMLPLを含む）で浸潤した葉組織のトータルイオンクロマトグラム。トータルイオンクロマトグラム (TIC) および抽出イオンクロマトグラム (EIC) の 531.2336 m/z の保持時間 4.09 分のピークはストリクトシジン標準と一致します。 ND、検出されません。 7-DLH、7-デオキシロガン酸ヒドロキシラーゼ; LAMT、ロガン酸 O-メチルトランスフェラーゼ。 SLS、セコロガニンシンターゼ。 TDC、トリプトファンデカルボキシラーゼ。 STR、ストリクトシジンシンターゼ。値およびエラーバーは、n = 3 または n = 6 の生物学的複製 (独立した葉サンプル) の平均および標準誤差を表します。

また、以前に同定された、UGT94E7 (グループ A) または NbUGT85A73 (グループ G) に変異を持つ系統に全経路を浸透させました。これらの系統では、それぞれ、より少ない初期イリドイド誘導体の蓄積が示されていました。ただし、ストリクトシジンまたはストリクトシジン副産物の収量には変化は観察されませんでした（補足図13）。

7-DLAおよびストリクトシジン生成の収量に対する葉緑体およびサイトゾル酵素局在の影響を比較するために、各酵素にトランジットペプチドを追加しました（またはGPPS / GESの場合は削除しました）（図6、補足データ1）。サイトゾルにおけるイソプレノイド前駆体の流動を強化するために、我々は、以前に力価を改善することが示されているオート麦由来の短縮型3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-コエンザイムAレダクターゼ（tHMGR）を共浸潤させることにより、メバロン酸経路の律速段階を緩和することを目的とした。 N. ベンサミアナのトリテルペノイド β-アミリンの研究。すべての酵素がサイトゾルに局在する場合、セコイリドイド経路を通るフラックスは最小限でしたが（7-DLAの約90分の1の減少）、一方、すべての経路の酵素が葉緑体に局在すると、7-DLAは5分の1に減少しました（図6a、補足データ 1)。 7-DLA (図6a、補足データ1) およびストリクトシジン (図6b、補足データ1) の最良の収率は、初期経路の葉緑体局在化および後続のステップのサイトゾル局在化で得られ、これはネイティブな局在化パターンを模倣しました。 C.ロゼウス。葉緑体における 7-DLA の生成は、G8H のパートナーである P450 レダクターゼとイリドイドオキシダーゼ (IO)、または 7-DLGT の UDP-グルコースなどの小分子基質の利用可能性によって制限される可能性がありますが、サイトゾルと葉緑体は依然として 7-DLA を生成しており、このことは経路中間体が葉緑体膜を通過できることを示しています。

7-DLA (a) およびストリクトシジン (b) 生合成遺伝子のサイトゾル (青) または葉緑体 (緑) への再配置により、生成物の収量が減少します。 tHMGR、短縮型 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-コエンザイム A レダクターゼ。値とエラーバーは、n ≥ 3 の生物学的複製 (独立した葉サンプル) の平均と標準誤差を表します。

この研究では、N. ベンサミアナにおけるイリドイドおよび MIA 経路の生合成中間体および生成物の生産を改善することに着手しました。以前の研究では、N. ベンサミアナをテルペノイド天然産物の異種発現の宿主として使用すると、さまざまなテルペノイド誘導体が蓄積し、一部の分子タイプの生産のためのシャーシとしてのこの種の使用が制限される可能性があることが報告されています8,9、 10、11、12、13、14。以前の研究で見つかったように、我々はここで、初期のイリドイド生合成中間体がペントースおよびヘキソース糖の添加によって頻繁に修飾されることを観察し、N.ベンサミアナファミリー1UGTの関与を示唆しています（図1および補足表1）。さらに、遺伝子発現がアグロ浸潤の影響を受けることはすでに知られていますが43、比較トランスクリプトミクスにより、一部の内因性UGTの発現がモノテルペンまたはイリドイド代謝経路の発現によってさらに調節されることが明らかになりました（補足表2）。これは、植物がアグロバクテリウムの浸潤に反応するだけでなく、外来酵素および/または代謝産物の存在にも反応することを示しています。

N. ベンタミアナは多くのモノテルペンを蓄積しませんが、これらの内因性 UGT はより大きな修飾された代謝産物の生合成に関与している可能性があり、したがって初期のイリドイド中間体に対して無差別に作用することができます。あるいは、それらは、病原体によって生成される生理活性物質から保護するための生体異物解毒機構の一部である可能性があります。私たちは、これらの酵素が必須である可能性は低いと推論し、これらの酵素の活性を特定して除去することによってベンタミアナタバコの菌体を改善することに焦点を当てました。 Cas9ベースの分子ツールを使用して、20のUGT標的遺伝子に機能喪失型変異を導入しました（表1および補足図2〜5）。我々は、複数の sgRNA とともに Cas9 を構成的に発現するトランスジェニック植物の作出 45 と、最近報告された Cas9 導入遺伝子を持つ植物で可動性 sgRNA を一時的に発現させるウイルスベクターの使用 38 の 2 つのアプローチを採用しました。前者の方法を使用すると、ほとんどまたはすべての標的系統に変異のある系統を回収できましたが、モバイル sgRNA メソッドは、効率は劣るものの、労力が少なく、多くの標的遺伝子を調査するためにより簡単に拡張できます。

対照系統と比較して、グループA UGT、NbUGT94E7に変異がある植物は、トリヘキソシルゲラン酸として推定されるピーク（m/z 699.2713、[M + HCOOH-H]）を蓄積しなくなりました（図3、補足図6）。および7）。この UGT には、モノグルコシルトランスフェラーゼのループ構造を定義するのに重要であると提案されている GSS モチーフも欠如しています 37,39,40,41,42,43,44,46。さらに、グループG UGT、NbUGT85A73に変異がある植物では、対照系統と比較して4つのピークが減少または欠如していることも確認しました（図3および補足図6および7）。この UGT は、ゲラニオール 37 に対して活性であることが以前に報告されています。驚くべきことに、これらのピークは、ネペタラクトールを生成するために必要なすべての経路酵素が浸潤した植物でのみ除去され、ゲラニオール発現のための経路遺伝子が存在する場合には依然として残存した。おそらく、ヘキソシルヒドロキシゲラニオール (m/z 377.1817、[M + HCOOH-H]) およびヘキソシルヒドロキシシトロネラール (m/z 379.1974、[M + HCOOH-H]) は 8-ヒドロキシゲラニオールのグリコシル化によって生成されるため、次の式が必要となります。ゲラニオール 8-オキシダーゼの。しかし、延長経路が浸潤した場合にのみペントシルヘキソシルゲラニオール (m/z 493.2288、[M + HCOOH-H]) およびアセチルジヘキソシルゲラニオール (m/z 519.22425、[MH]) の蓄積が減少した理由は不明です。

我々のアプローチは、誘導体の蓄積を減らすことによって、小さなテルペノイド型分子の生物生産シャーシとしてN.ベンサミアナを改善するための遺伝子編集アプローチの応用の概念実証を提供します。しかし、個々のUGTの変異によりマイナーピークの蓄積が減少することが観察されました。影響を与えるには、複数の遺伝子に変異をもつ系統を作出して、目的の代謝産物の収量に劇的な影響を与える必要がある場合があります。また、追加の酵素の共発現によって経路が延長されると、観察される派生ピークが減少することもわかりました (図 1、4、および 5)。これは、経路酵素が基質に対して高い親和性を持ち、特に強力なプロモーターから発現された場合、基質に関して内因性酵素を打ち負かす可能性が非常に高いことを示唆しています。ストリクトシジンは極性のグリコシル化分子であり、貯蔵のために液胞に隔離されている可能性が高く、その疎水性イリドイド前駆体よりも誘導体化されにくいです。実際、ストリクトシジンの経路が、より少ない誘導体または初期経路中間体を生成する系統で発現された場合、野生型N.ベンサミアナでの発現と比較して収量に変化はありませんでした（補足図13）。

我々は、光合成生物の中枢代謝による大量のストリクトシジン (0.23 ± 0.11 mg/g DW) の生成を実証することができました。また、ネペタラクトールの形成に必要な重要な環化ステップを改善することにより、ストリクトシジンの生産を強化しました。口語的にイヌハッカまたはキャットミントとして知られる植物属 Nepeta L. は、セコイリドイド経路の初期部分を使用してネペタラクトンを生成します。最近の研究により、Nepeta41 では、シス-トランスネペタラクトールの生成が MLPL によって補助されていることが明らかになりました。 ISYの反応性エノール生成物の環化を補助するN. mussiniiからのMLPLの異種発現は、セコイリドイド経路のボトルネックを克服し（図4）、N. ベンサミアナにおけるストリクトシジンの異種生産を可能にするために重要でした（図5）。 MLPL も同様に、酵母などの微生物のセコイリドイド代謝工学を強化します 31。さらに、無細胞 in vitro ワンポット酵素カスケードには、MLPL と他の 9 つの経路酵素、アクセサリータンパク質、補因子再生酵素が含まれており、約 1 g/L のネペタラクトン 42 を生成しました。

C. ロゼウスの MIA 経路は、細胞内コンパートメントおよび細胞タイプにわたって高度に区画化されています。最初に関与するステップはゲラニオール合成 (GES) であり、これは内部師部関連実質細胞の葉緑体に局在しています 47。 GES の基質の利用可能性を高めるために、我々は P. abies から GPPS を共発現させました 48。これは Miettinen らによっても利用されました 14。葉緑体を標的とした PaGPPS の発現は、ゲラニオールの生産に対する以前に報告された効果と一致して、収量を約 5 倍向上させました (図 5)。注目すべきことに、PaGPPSは、テルペン代謝工学で一般的に使用される他の6つのGPPS配列と比較して、インビトロでより高いレベルのモノテルペンリモネンを生成することが示されたPicea glaucaからのGPPSとほぼ同一です（補足図14）。また、C. ロセウスから DXS を共発現させました。興味深いことに、以前に報告されたジテルペノイドの生成に対する DXS の効果とは対照的に、CrDXS はストリクトシジンの収量に比較的ほとんど影響を与えませんでした 10,50。

代謝経路を設計するための最近の取り組みでは、経路酵素の区画化を変更することに利点があることがわかっています 13,51。例えば、シアン生成グルコシドのジュリンを生成する経路は、タバコの葉緑体に再配置され、光合成電子伝達系を介して還元されるフェレドキシンが、経路内の 2 つのシトクロム P450 (CYP) への効率的な電子供与体として機能することができます 52。さらに、アルテミシニン経路の後期段階をコードする酵素が N. tabacum の葉緑体に局在することにより、N. tabacum 内での局在と比較して、より高いレベルのアルテミシニン (800 μg/g DW)53 およびアルテミシン酸 (~1200 μg/g DW)54 が生成されました。サイトゾル (6.8 μg/g DW アルテミシニン)55。この増加はおそらく、代謝産物が生存率に影響を及ぼし、内因性グリコシルトランスフェラーゼによる望ましくない誘導体化にさらされる可能性があるサイトゾルからの代謝産物の単離によるものである11、12、56。 N. ベンサミアナにおけるハロゲン化インジカン 57 とバニリン 58 の生成も葉緑体局在の恩恵を受けました。対照的に、最近の報告では、葉緑体 MEP 経路ではなく細胞質メバロン酸経路を利用して GGPP を生成することにより、ジテルペノイド (通常は葉緑体で合成される) の生成が劇的に増強されることが判明しました 59。

この研究では、ベンタミアナタバコの葉内でストリクトシジンへの経路を再構築するための最適な構成は、イソプレノイド前駆体の葉緑体 MEP 経路を利用してゲラニオールを生成し、残りの経路酵素を局在化する C. ロゼウスの局在化パターンと一致することであることがわかりました。サイトゾル（図4）。 GPPS によって生成される GPP (炭素数 10) は、ファルネシルピロリン酸 (FPP) (炭素数 15) を生成する N. ベンサミアナファルネシルピロリン酸シンターゼ (FPPS) の基質でもあるため、サイトゾルでのモノテルペンの生成は制限されていると仮説を立てます。この仮説を裏付けるデータは、NbFPPS の 4 つのコピーすべてが、Phytophthora infestans に応答してセスキテルペノイドのフィトステロールとフィトアレキシンを生成するように上方制御されていることを示唆しています60。 A. tumefaciens は、N. benthamiana に浸潤すると広範な転写リモデリングも誘発します 35。 GES と FPPS の間のこの競合は、以前に報告された色素体中のゲラニオールおよびゲラニオール誘導体のレベルが高いことも説明できる可能性があります 13。異種生産中にNbFPPSを条件付きで不活性化する将来の取り組みにより、ゲラニオール生産への色素体と細胞質ゾルの両方の経路を利用できる代謝工学戦略が可能になる可能性がある。

C. ロゼウスでは、ゲラニオールは色素体から細胞質ゾルに拡散または輸送されて、ER 膜の外側につながれている G8H と反応します。次のステップ (G8H からデオキシロガン酸ヒドロキシラーゼ (7-DLH)) は、師部関連実質細胞のサイトゾルで活性であり、2 つの CYP (G8H および IO) も ER 膜に固定されています 14。次に、ロガン酸は NPF2.4/5/661 によって表皮細胞に輸送され、そこでさらに 4 つの酵素 (LAMT からストリクトシジンシンターゼ (STR)) によってストリクトシジンが生成されます 62,63。トリプタミンとセコロガニンは液胞に輸入され、そこでストリクトシジンが合成され、トランスポーターNPF2.964を介したストリクトシジンの輸送により蓄積されます。したがって、4 つの経路 CYP (G8H、10、7-DLH、およびセコロガニンシンターゼ) は、NADPH の CYP への電子伝達のために内在性ベンサミアナタバコ CYP レダクターゼと相互作用している可能性があります。必要な CYP レダクターゼが葉緑体にあまり存在しないため、この区画でのストリクトシジンの蓄積が制限されている可能性があります。また、CYP450 が膜に不適切に固定されているか、葉緑体の間質の pH が高い (~8.0)65 ため、サイトゾル (pH ~7.0) と比較して酵素活性が阻害されている可能性もあります。また、葉緑体における（7-DLAと比較して）ストリクトシジン生成レベルが低いことを説明するために、LAMTの追加補因子であるS-アデノシルメチオニン（SAM）が欠如していることも考慮しました。しかし、この小分子は、色素体に活発に輸送されることが知られており 66 、葉緑体内のクロロフィル生合成に関与する ChlM (Mg-プロトポルフィリン IX メチルトランスフェラーゼ) の必須基質です。

植物におけるストリクトシジンの生産は、生物学的合成を使用して豊富な MIA 製品を生産するための新しい道を開きます。この種の内因性代謝はモノテルペンの蓄積には有害ですが、複雑な分子の蓄積を可能にします。特に追加のMIAの新しい生合成経路が発見されているため（抗中毒性化合物イボガイン67、抗マラリア薬キニーネ68など）、この研究をプラグアンドプレイ方式で下流の生合成モジュールと組み合わせる可能性は、天然産物の刺激的な見通しである。合成。

アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介一過性発現（アグロ浸潤）用のバイナリーベクターは、C. ロゼウス cDNA から増幅したコード配列を pEAQ-HT-DEST1 ベクター (GenBank GQ497235、補足表 4)69 にクローニングすることによって組み立てるか、植物を使用して発現構築物に組み立てます。モジュラークローン (MoClo) ツールキット 70。後者の場合、コード配列を合成し（Twist Bioscience、カリフォルニア州サンフランシスコ）、同義変異の導入により天然の葉緑体輸送ペプチド配列およびBpiI、BsaI、BsmBI、およびSapI認識部位のインスタンスをすべて除去するか、Cから増幅しました。ＢｐｉＩ（ＢｂｓＩ）認識部位を含むオーバーハングを有するＰＣＲによるロゼウスｃＤＮＡ。アンプリコンは、前述のように pUAP1 (Addgene #63674) にクローン化され 71、フィトブリックアセンブリ標準と互換性のあるオーバーハングを生成する BsaI 認識部位の反転ペアが隣接するレベル 0 部分 (Addgene #177019 〜 177032) が得られました 72 (補足表 5)。これらのレベル 0 部分は、CaMV 35 s プロモーター (CaMV35s) とタバコモザイクウイルス (TMV) の 5' UTR、および必要に応じて合成葉緑体トランジットをコードするレベル 0 部分を使用して、ワンステップクローニング反応 71 でレベル 1 アクセプターに組み立てられました。ペプチド配列（補足表6）を使用して細胞内局在を変更します。

N. ベンタミアナ植物は、22 °C、湿度 80%、光強度約 200 μmol/m2/s の制御された環境の部屋で、16 時間明、8 時間暗で生育しました。エレクトロコンピテント A. tumefaciens GV3101 (MoClo ベクター) または LBA4404 (pEAQ ベクター) を目的の遺伝子をコードするバイナリープラスミドで形質転換し、個々のコロニーを使用して抗生物質 50 μg/mL リファンピシン、20 μg/mL ゲンタマイシンを含む液体 LB 培地に接種しました。、および 100 μg/mL カルベニシリン (MoClo ベクター) または 50 μg/mL リファンピシン、100 μg/mL ストレプトマイシン、および 50 μg/mL カナマイシン (pEAQ ベクター)。一晩飽和した培養物を室温で 3400 × g で 30 分間遠心分離し、細胞を浸潤培地 (10 mM 2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸 (MES) pH 5.7、10 mM MgCl2、200 μM 3',5) に再懸濁しました。 '-ジメトキシ-4'-ヒドロキシアセトフェノン (アセトシリンゴン)) を加え、ゆっくりと振盪しながら室温で 2 ～ 3 時間インキュベートしました。再懸濁したすべての培養物を 0.8 OD600nm (MoClo) または 0.5 OD600nm (pEAQ) に希釈し、実験条件に応じて等しい比率で混合しました。 MoClo ベクターの場合、異種発現を増加させることが以前に示されているトマトブッシュスタントウイルス (TBSV) の遺伝子サイレンシングの P19 サプレッサーを発現する遺伝子をコードする別の A. tumefaciens 株がすべての浸潤に含まれていました 69。完全に展開した本葉が 3 ～ 4 枚ある健康な植物 (生後 29 ～ 37 日) に、1 mL の針なし注射器を使用して葉の背軸側に浸潤させ、MLR-352-PE 植物成長チャンバー (パナソニックヘルスケア) で 5 日間生育させました。 Co、大泉町、日本）、22 °C、光強度 120 ～ 180 µmol/m2/s で 16 時間明、8 時間暗。すべての化合物は Sigma-Aldrich (ミズーリ州セントルイス) から購入しました。

浸潤の 5 日後、浸潤した N. ベンタミアナ葉組織 100 ～ 300 mg を 1.5 mL 微量遠心管に収集し、液体窒素中で急速冷凍しました。 -49 °C、300 mTorr に設定した VirTis BenchTop SLC 凍結乾燥機 (SP Industries、米国ニューヨーク州ストーンリッジ) を使用して、葉組織を一晩凍結乾燥しました。次いで、２０Ｈｚに設定したＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ、ヒルデン）上で３ｍｍの炭化タングステンビーズ（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号／ＩＤ：６９９９７）を使用して、サンプルを２０秒間粉砕して粉末にした。凍結乾燥した葉組織を 70% メタノール + 0.1% ギ酸 (1:100、wv) で抽出しました。溶媒には、内部標準として 10 μM のハルパゴシド (Extrasynthese、Genay、フランス) が含まれていました。抽出は室温で 1 時間、10 分間超音波処理し、50 分間一定に振盪しながら実行されました。サンプルを 17,000 × g で 10 分間遠心分離して破片を分離し、超高速液体クロマトグラフィー質量分析 (UPLC/MS) 分析の前に 0.2 µm PTFE ディスクフィルターで濾過しました。

UPLC/MS 分析は、Elute UPLC (Bruker) クロマトグラフィーシステムに接続された Impact II qTOF 質量分析計 (Bruker) で実行されました。クロマトグラフィー分離は、40 °C に保たれた Phenomenex Kinetex カラム XB-C18 (100 × 2.10 mm、粒子サイズ 2.6 μm) で実行され、二成分溶媒系は溶媒 A (H2O + 0.1% ギ酸) と溶媒 B (アセトニトリル）。流速は600μL/分であった。カラムは 99% A と 1% B で平衡化されました。クロマトグラフィーの最初の 1 分間で、溶媒 B は 5% に達しました。次に、5 分間で 5% B から 40% B までの直線勾配により、目的の化合物を分離できました。次いで、カラムを１００％Ｂで１．５分間洗浄し、１％Ｂに再平衡化した。注入量は２μＬであった。質量分析は、スキャン範囲 m/z 100 ～ 1000 の正イオンモードと負イオンモードの両方で実行されました。質量分析計はギ酸ナトリウム付加物を使用して校正されました。ソース設定は次のとおりでした: キャピラリー電圧 3.5 kV、ネブライザー 2.5 Bar、乾燥ガス 11.0 L/min、乾燥温度 250 °C。データ分析は、Bruker Data Analysis ソフトウェアを使用して実行されました。 7-デオキシロガン酸 (7-DLA)、ロガニン、ロガン酸、ストリクトシジンの定量は、純粋な化合物を使用して生成された検量線に基づいて行われました。ロガニンおよびロガン酸は Sigma から購入しました。 7-デオキシロガン酸とストリクトシジンは、以前に記載されているように合成されました73,74。標準を 70% メタノール + 0.1% ギ酸で希釈して、40 nM ～ 10 μM の濃度の 9 つのキャリブラントを得ました。この濃度範囲のすべての化合物について線形応答が観察されました (R2 > 0.993)。代謝物の推定上の同定は、データ分析ソフトウェア (Bruker) を使用して最適な元素組成を決定するための高分解能質量分析データの取得に基づいていました。

アグロインフィルトレーション実験は、4 セットの pEAQ ベクターを使用して上記のように実行されました: (1) 低ゲラニオール (GFP、CrGES)、(2) 高ゲラニオール (GFP、CrDXS、CrGGPPS.LSU、CrGES)、(3) ネペタラクトール (GFP、CrDXS) 、CrGGPPS.LSU、CrGES、CrG8H、Cr8HGO、CrISY）、および（4）浸潤制御（GFP のみ）（補足表 7）。各条件の 3 つの生物学的複製からの葉組織と模擬浸潤対照を浸潤の 5 日後に収集し、液体窒素中で急速冷凍しました。全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙｐｌａｎｔｍｉｎｉｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、組換えＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）処理を行って単離した。ライブラリは、TruSeq RNA プロトコル v2 (Illumina 15026495 Rev.F) を使用して、Sciclone® G3 NGSx ワークステーション (PerkinElmer、マサチューセッツ州ウォルサム) 上で構築されました。 RNA の品質は、Quant-iT™ RNA アッセイキット (Life technology/Invitrogen Q-33140) を使用して評価されました。ビオチンビーズを使用して 1 μg の RNA を精製してポリアデニル化 mRNA を抽出し、断片化し、ランダム六量体でプライムして第一鎖 cDNA を生成し、続いて第二鎖を合成して ds cDNA を生成しました。サンプル末端を平滑化し、A テールを付け、対応する T オーバーハングを持つインデックスアダプターをライゲーションしました。ライゲーションされた産物はサイズ選択され、ライゲーションされていないアダプターは XP ビーズ (Beckman Coulter A63880) を使用して除去されました。アダプターに対する PCR プライマーのカクテルを使用してサンプルを増幅しました。ライブラリーのインサートサイズは、LabChipGX (PerkinElmer 5067-4626) および DNA High Sensitivity DNA 試薬 (PerkinElmer CLS760672) を使用して検証されました。等モル量の各ライブラリーをプールし、プールあたり 5 つのライブラリーをプールし、HiSeq 2500 の 1 つのレーンでシーケンスして、100 塩基対のペアエンドリードを生成しました。データ分析は、Web ベースの Galaxy インターフェイス (https://galaxy.earlham.ac.uk) を使用して実行されました75。 N. ベンタミアナドラフトゲノムアセンブリ v0.5 http://benthgenome.qut.edu.au/76 は、アグロバクテリウム C58 のゲノムとプラスミドを含むように拡張されました (Genbank AE007869.2、AE007870.2、AE007871.2、および AE007872) .2) および浸潤に使用される pEAQ ベクター (補足表 4)。 RNA-seq からのすべてのショートリードは、hisat2 v2.1.0 のデフォルトパラメーターを使用して拡張されたゲノムにマッピングされました。組み立てられた転写物は、Stringtie v1.3.3.1 を使用して生成されました。 n = 15 の実験サンプルからの転写は、Stringtie merge v1.3.3 を使用して統合されました。 hisat2 v2.1.0 を使用して、すべてのショートリードを拡張ゲノム (今回は参照としてマージされたトランスクリプトームを使用) に再度アライメントしました。差次的発現テーブルは、DESeq2 v2.11.40.1 を使用して生成されました。マージされたトランスクリプトームからの転写物は、トランスデコーダーを使用して翻訳され、最長のコード配列には、Swiss-Prot タンパク質データベース (2018 年 5 月にアクセス) を参照として phmmer v3.1v2 を使用して注釈が付けられました。

ファミリー 1 グリコシルトランスフェラーゼ (GT1、タンパク質ファミリー (Pfam) PF0201 または PF3033) として注釈が付けられた配列をコードする N. ベンサミアナ転写産物を分析した結果、327 アミノ酸を超える 77 の配列が得られ、無傷の植物二次産物グリコシルトランスフェラーゼ (PSPG) ボックスが含まれていました。シロイヌナズナ由来の 107 個の UGT のタンパク質配列は、記載されているように、シロイヌナズナのシトクロム P450、シトクロム b5、P450 レダクターゼ、β-グルコシダーゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼサイト (http://www.p450.kvl.dk) から取得しました 33。追加の 9 つの UGT 配列は、Actinidia deliciosa (キウイフルーツ)77、Camellia sinensis (お茶)78、C.roseus79、クチナシ (ケープジャスミン)80、ソルガムビカラー 81、ヴィティスヴィニフェラ (ブドウ) 由来のゲラニオールまたは他のイリドイド基質に対して活性があることが以前に報告されています。 )82,83も含まれていました。配列およびアクセッション番号は補足表 8 にリストされています。193 の配列は MUSCLE 3.8.425 (Edgar 2004) を使用してアラインメントされ、100 のブートストラップを含む系統樹は Geneious プログラム内の RAxML バージョン 8.2.1184 を使用して生成されました。系統樹は、Interactive Tree Of Life (iTOL)85 を使用して視覚化されました。

所望の標的に対する Cas9 およびシングルガイド RNA (sgRNA) を発現するバイナリーベクターは、前述のように植物モジュラークローニングツールキット 71 を使用して組み立てられました 45。簡単に言うと、所望の sgRNA スペーサー (補足表 9) をコードするプライマーを使用して、Chen らによって報告された sgRNA ステム伸長足場を PCR 増幅しました 86。得られた PCR アンプリコンは、シロイヌナズナ U6-26 プロモーター (AtU6-26 Addgene#68261) または N. ベンタミアナ U6 プロモーター (NbU6-1 Addgene#185623 および NbU6-2 Addgene#185624) のいずれかをコードするレベル 0 部分で組み立てられました (補足表9)。 N. ベンタミアナ由来の U6 プロモーターは、シロイヌナズナ U6-26 との配列相同性によって同定され、以前に記載されているように一時的な浸潤によって有効性が確認されました 45。得られたレベル1構築物は、カナマイシンに対する耐性を付与し、Cas9の構成的発現のために合成遺伝子を用いて組み立てられた(補足図15)。 sgRNA の有効性は、以前に記載されているように一過性の浸潤によって確認されました 45。得られた構築物を、植物形質転換のために高毒性A.ツメファシエンス株AGL1に形質転換した。個々のコロニーを使用して、抗生物質 (50 μg/mL カナマイシンおよび 50 μg/mL リファンピシン) を含む 10 mL LB 培地に接種しました。一晩飽和した培養物を室温で 3000 × g で 10 分間遠心分離し、細胞を 100 μM アセトシリンゴンを含む 10 mL MS 培地に再懸濁し、光学密度 OD600 を 0.6 ～ 0.8 に調整しました。 N. ベンタミアナは、以前に報告されているように 87 、わずかな変更を加えて形質転換されました。生後 4 週間の開花していない植物から若い葉を採取し、表面を殺菌しました。 1 ～ 2 cm の正方形にアグロバクテリウムを室温で 5 分間接種し、滅菌濾紙上で水分を拭き取り、MS 基礎塩 88、ガンボルグ B5 ビタミン 89、3% (w/v) を含む共培養培地 pH 5.8 上に背軸側を下にして置きました。スクロース、0.59 g/L MES 水和物、6 g/L アガロース、6-ベンジルアミノプリン (BAP、1.0 mg/L)、およびナフタレン酢酸 (NAA、0.1 mg/L)。外植片を白色蛍光灯（16時間明/8時間暗）下、22±2℃で3日間共培養し、その後、MS基礎塩、ガンボルグB5ビタミン、3%（w/v）スクロース、0.59を含む選択培地に移した。 g/L MES水和物、6 g/L 寒天ゲル、6-ベンジルアミノプリン (BAP、1.0 mg/L) およびナフタレン酢酸 (NAA、0.1 mg/L)、100 mg/L カナマイシンおよび 320 mg/L チカルシリン。外植片を新鮮な選択培地上で14日間隔で継代培養した。推定上のトランスジェニックシュートを、1 mg/L インドール-3-酪酸、0.5% スクロース、0.3% ゲルライト、100 mg/L カナマイシンおよび 320 mg/L チカルシリンを補充した、ビタミンを含む MS 塩 (半分の強度) を含む発根培地で培養しました。。苗木を MagentaTM 容器 (Sigma) 内の滅菌泥炭ブロック (Jiffy7) に移した後、泥炭ベースの堆肥 (90% 泥炭、10% 砂、4 kg/m3 ドロマイト石灰石、0.75 kg/m3 複合肥料 (PG Mix)) に移植しました。 ™)、1.5 kg/m3 徐放性肥料 (オスモコートブルーム)) を加え、温室に移しました。

TRV2 プラスミドベクター SPDK3888 (Addgene #149276) は、Savithramma Dinesh-Kumar および Dan Voytas から感謝の気持ちを持って受け取りました。これを、ＡａｒＩ制限部位および選択用のｌａｃＺカセットを追加することによって改変して、ｐＥＰＱＤ０ＫＮ０７５０（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１８５６２７）を生成した。選択された標的のスペーサー配列は、以前に記載されているように、AarI 部位への Golden Gate アセンブリによって pEPQD0KN0750 に組み込まれました 38 (補足表 10)。構築物を A. tumefaciens GV3101 に形質転換し、個々のコロニーを使用して 50 μg/mL リファンピシン、20 μg/mL ゲンタマイシン、および 50 μg/mL カナマイシンを含む LB 培地に接種し、28 °C で一晩振とうしながら増殖させました。飽和培養物を遠心分離し、培養物を０．３ＯＤ６００ｎｍに希釈し、アグロバクテリウム株をｐＴＲＶ１（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１４８９６８）を含む株と等しい比率で混合したことを除いて、上記と同様に浸潤培地に再懸濁した。 Cas9 を構成的に発現するトランスジェニック N. ベンサミアナ植物 (Cas9 Benthe 193.22 T5 ホモ接合体) の種子を Dan Voytas から感謝して受け取り、22 ± 2 °C の温室で 6 週間生育させました。植物を上記のように浸潤させ、13週間生育させた後、葉組織のサンプルを2つの異なる茎(AおよびBと呼ぶ)から採取した。

アグロバクテリウム媒介の安定形質転換によって生成された T0 植物、または可動性 sgRNA を発現する RNA ウイルスが浸潤した植物の 2 本の茎から採取した葉から、40 ～ 60 mg の葉組織サンプルを収集しました。ゲノム DNA は前述のように単離されました 45。標的遺伝子座は、プルーフリーディングポリメラーゼ (Q5® High-Fidelity DNA Polymerase、New England Biolabs、イプスウィッチ、マサチューセッツ州) および標的部位に隣接するプライマーを使用して増幅しました (補足表 11)。アンプリコンはサンガー配列決定法（Eurofins、ルクセンブルク）によって配列決定された。遺伝的キメラ現象、ヘテロ接合性または両対立遺伝子変異のいずれかの存在を示唆する複数のピークを持つアンプリコンは、アンプリコンを Zero Blunt™ TOPO™ (Thermo Fisher、マサチューセッツ州ウォルサム) または pGEM®-T Easy (Promega、ウィスコンシン州マディソン) にクローニングすることによって解決されました。続いて、10 ～ 15 個のコロニーから単離されたプラスミドの配列決定が行われます。アグロバクテリウム媒介の安定形質転換によって生成された植物については、T0 植物の T-DNA コピー数を、nptII に対するプライマーと単一コピーの参照遺伝子 Rdr191 を使用して、前述のとおり 90 ddPCR によって推定しました。標的位置にホモ接合性、ヘテロ接合性、または両対立遺伝子変異を有する単一コピー植物からの T1 種子を収集し、その後の分析のために栽培しました。 RNA ウイルスとモバイル sgRNA を使用して生成された植物の場合、突然変異が検出された茎の遠位端にある個々のさやから種子 (E1 と指定) を収穫しました。 T1およびE1を増殖させ、上記のように各標的遺伝子座の遺伝子型を確認した。

トランスクリプトーム分析、変異植物の派生ピークの評価、および収量の定量化には、最小 n = 3 の生物学的複製が使用されました。 7-デオキシロガン酸 (7-DLA) およびストリクトシジンの定量を含む重要な実験は、n = 6 または n = 11 になるように繰り返しました。収量の変化は、事後 Tukey HSD を使用した一元配置分散分析を使用して分析されました。除外されたデータはありませんでした。葉にアグロインフィルトレーションされたサンプルの配置は、所定の実験内で葉全体および植物全体にわたってランダム化されました。誘導体の同定と代謝産物の定量化のため、実験計画、葉浸潤、サンプル収集は 1 人の研究者によって実行され、サンプルは別の研究者によって盲目的に分析されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

プラスミドの配列と DNA サンプルは、Addgene (#177019 - #177092) に寄託されています。トランスクリプトームデータは、プロジェクト ID PRJNA841421 で NCBI Sequence Read Archive データベースに保管されています。すべてのグラフの数値ソースデータは補足データ 1 に提供されます。

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MLPL との協力について指導してくださった Benjamin Lichman に感謝します。また、Galaxy 内での RNAseq 解析を支援していただいた Nicola Soranzo 氏と、データ管理と提出を支援していただいた Yaomin Cai 氏にも感謝します。 pL0-AstHMGR は、アンオズボーンからの寛大な贈り物でした。プラスミド pNJB069 (pTRV1)、pEE393、および pEE515 と、SpCas9 を発現する N. benthamiana の種子は、Dan Voytas からの寛大な贈り物でした。ライブラリーの調製と配列決定は、アーラム研究所のゲノミクスパイプライングループのメンバーによって、BBSRC National Capability in Genomics and Single Cell Analysis (BBS/E/T/000PR9816) を介して実施されました。また、植物栽培にご協力いただいたレスリー・フィリップス氏、キャサリン・テイラー氏、JIC園芸サービスにも感謝いたします。著者らは、英国研究とイノベーションの一部であるバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会 (BBSRC) の支援に感謝の意を表します。この研究は、BBSRC コア戦略プログラム助成金 BB/CSP1720/1 とその構成作業パッケージ BBS/E/T/000PR9819 制御相互作用と複雑な表現型、および Leaf Expression Systems との産業パートナーシップ賞 (BB/P010490/1) によって資金提供されました。。 SOC は、マックスプランク協会と欧州研究評議会 (ERC 788301) の支援も認めています。資金提供者は、研究の設計、データの収集と分析、出版の決定、原稿の準備には何の役割もありませんでした。

ナサニエル・H・シャーデン

現在の住所: Octagon Therapeutics Ltd、700 Main Street、North Cambridge、MA、02139、USA

Engineering Biology、アーラム研究所、ノーリッチリサーチパーク、ノーリッチ、ノーフォーク、NR4 7UZ、英国

クエンティン・M・ダドリー、ソヒョン・ジョー、ニコラ・J・パトロン

天然産物生合成部門、マックス・プランク化学生態学研究所、イエナ、07745、ドイツ

デリア・アイレッド・セルナ・ゲレーロ、サラ・E・オコナー、ロレンツォ・カプティ

ジョン・イネス・センター、ノリッジ・リサーチ・パーク、ノリッジ、NR4 7TJ、英国

モニカ・チェトリー、マーク・A・スメドレー、ウェンディ・A・ハーウッド、ナサニエル・H・シャーデン

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QMD、SEO、LC、NJP がこの研究を考案しました。 QMD は、構築された SJNHS の支援を受けて DNA アセンブリと一過性発現を実行し、pEAQ ベクターを使用した浸潤実験を実行しました。 QMD はトランスクリプトーム解析を実行し、突然変異誘発用のすべてのベクターを組み立て、突然変異誘発用の RNA ウイルスを送達し、ジェノタイピングを実行しました。 MC と MAS は WAHDASG の監督の下ですべての植物組織培養を実施し、LC は代謝物の抽出と分析を実施しました。 QMD、SEO、LC、NJP が原稿を執筆しました。 SEOとNJPは資金を獲得し、監修を行った。

ロレンツォ・カプティまたはニコラ・J・パトロンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

主な編集者: Zhijuan Qiu。

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転載と許可

ダドリー、QM、ジョー、S.、ゲレロ、DAS 他ゲノム操作されたニコチアナ・ベンサミアナにおけるモノテルペンインドールアルカロイド生合成の再構成。 Commun Biol 5、949 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-03904-w

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受信日: 2022 年 7 月 4 日

受理日: 2022 年 8 月 25 日

公開日: 2022 年 9 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03904-w

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