眼感染から回復したアカントアメーバの遺伝子型、内部共生生物および臨床的特徴の評価

BMC 感染症第 22 巻、記事番号: 757 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

アカントアメーバは新興病原体であり、抗原虫化合物、消毒剤、過酷な環境に対する耐性で悪名高い。これは、視力を脅かす、痛みを伴う治療が難しい角膜感染症である角膜炎を引き起こすことが知られており、コンタクトレンズ装用者や眼外傷患者の間でよく報告されています。アカントアメーバは 24 種以上で構成されており、現在 23 の遺伝子型 (T1 ～ T23) が特定されています。

この後ろ向き研究は、アカントアメーバ角膜炎 (AK) 患者から回収されたアカントアメーバの種と遺伝子型を検査し、アカントアメーバの眼分離株における内部共生生物の存在を確認し、臨床症状を検討することを目的として設計されました。

2020年2月から10月までインドのハイデラバードにある三次眼科施設で治療を受けた、文化が確認されたAK患者13人がこの研究に含まれた。すべての患者の臨床症状、投薬および視覚的結果は医療記録から得られました。アカントアメーバ分離株は、リボソーム核サブユニット (rns) 遺伝子の配列を決定することによって同定されました。アカントアメーバ分離株は、分子アッセイ、PCR、および蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (FISH) を使用して、細菌または真菌の内部共生生物の存在について評価されました。

患者の平均年齢は33歳（SD ± 17.4; 95% CI 22.5～43.5歳）でした。 6 例 (46.2%) は AK 関連の危険因子を持っていました。 4人の患者は眼外傷を負い、2人はコンタクトレンズ装用者でした。 A. culbertsoni (6/13、46.2%) が最も一般的な種で、A. ポリファーガと A. トライアングルリスがそれに続きました。分離株の大部分 (12/13) は遺伝子型 T4 に属し、1 つは T12 でした。 T4 遺伝子型内で 3 つのサブクラスター T4A、T4B、および T4F が同定されました。アカントアメーバの種類と臨床転帰との間に有意な関連はありませんでした。 8 株 (61.5%) の分離株には細胞内細菌が存在し、1 株にはマラセチアレストリクタが含まれていました。細胞内微生物の存在は、50% (2/9) と比較して、間質浸潤 (88.9%、8/9)、上皮欠損 (55.6%、5/9)、および下皮損傷 (55.6%、5/9) のより高い割合と関連していた。 4)、細胞内微生物が存在しない AK 症例はそれぞれ 25% (1/4)、25% (1/4) でした。

遺伝子型 T4 はインド南部で優勢な分離株でした。これは、インドの AK 患者から同定された T12 遺伝子型の 2 番目の報告ですが、世界的にはほとんど報告されていません。この研究におけるアカントアメーバ臨床分離株の大部分は細胞内微生物を保有しており、それがAKの臨床的特徴に影響を与える可能性がある。

査読レポート

アカントアメーバ角膜炎 (AK) は、世界の角膜感染症の 2% を占める稀な眼疾患です [1]。しかし、おそらくコンタクトレンズの使用の増加と、人工プールや処理された家庭用水供給を含むさまざまな水資源でのアカントアメーバ種の蔓延の増加により、AKの症例は世界的に増加しています[2]。子供の近視の進行を抑制できるコンタクトレンズの開発の影響もあり、コンタクトレンズの装用が世界中で増加しており、これにより失明につながる可能性のあるAK感染症を発症するリスクが子供たちを危険にさらす可能性があります[3]。 AK とコンタクトレンズ装用との関連性はしっかりと確立されており、コンタクトレンズ装用は報告されている感染症のほぼ 90% に関連しています [4]。報告されたアウトブレイクは、効果のないコンタクトレンズ消毒液に関連しているとされています[5、6]。アカントアメーバのライフサイクルには、感染性栄養型と休眠嚢胞段階が含まれます。後者は何年も生存し続けることができます[7]。

AK は診断が難しく、有効な治療法は非常に限られています [8、9]。アカントアメーバの嚢胞は、消毒剤、抗原虫薬、栄養素の枯渇に対して耐性があり、患者のケアに大きな課題をもたらしています [10]。さらに、眼感染症を治療するための一般的な薬の多くは、アカントアメーバには効果がありません。 AK 患者の診断と管理は難しいため、長期にわたる投薬につながり、治療の成功が非常に困難になり、大幅な視力喪失につながる可能性があります [11]。 AK 患者の 30% では病気をコントロールするために外科的介入が必要であり、まれに感染した眼が切除されることもあります [12]。さらに、アカントアメーバ嚢胞は感染が成立すると根絶するのが難しく、感染が再発する可能性があります[13]。治療を成功させるには正しい診断が不可欠ですが、AK の臨床徴候や症状はさまざまで、単純ヘルペスウイルス (HSV) 角膜炎などの他の眼感染症と類似しているものもあるため、診断は困難な場合があります。診断が確定するまでは、鎮痛剤、抗炎症剤、一般的な抗菌化合物が処方される可能性があります。アカントアメーバ角膜感染症の診断前の局所コルチコステロイドの以前の使用は、視覚的転帰の不良と関連している[14]。多目的コンタクトレンズ溶液および確立された抗アメーバ治療法に対する耐性が疑われるAKには、新しい治療アプローチによる高感度の診断手段が必要である[15]。

培養条件および単離源によって影響を受ける可能性がある細胞形態に基づいて、アカントアメーバ spp. は 3 つのグループに分類され、角膜炎を引き起こす株は最も一般的にグループ II に属します [7]。アカントアメーバ 18S rRNA 遺伝子配列に基づいて少なくとも 23 の遺伝子型 (T1 ～ T23) が同定されており、A. Castellani や A. Polyphaga などの一般的な角膜炎の原因種はクレード T4 に属します [16]。遺伝子型 T2、T3、T5、T6、T10、T11、T12、T13、T15、および T16 も AK 患者から回収されていますが、よりまれです [17、18、19]。アカントアメーバ 18S rRNA サブユニット (rns) 遺伝子配列の株間の変異は、亜属の遺伝子型を特定するために使用できます [20]。

アカントアメーバは、細菌、真菌、巨大ウイルスの宿主となり得る従属栄養性の原生生物です [21、22]。アカントアメーバとフザリウム属などの他の病原体との同時感染。または緑膿菌が角膜炎患者で観察されている[23]。これらの同時感染は、感染したアカントアメーバ内でのこれらの病原体の細胞内保菌が原因である可能性があります。さらに、アカントアメーバは、細菌性病原体が高等真核細胞に侵入するための訓練場として機能する可能性がある[24]。これらの細胞内微生物がAK病の治療と転帰にどのような影響を与えるかは不明ですが、細胞内微生物の存在がアカントアメーバ分離株の病原性を高めることが研究で報告されています[25、26]。本研究では、アカントアメーバ rns 遺伝子型およびサブ遺伝子型の疫学的分布とそれらの臨床症状を評価するために、インド南部の AK 患者から回収された 13 株のアカントアメーバ分離株が検査されました。アカントアメーバ分離株における細胞内細菌および真菌の存在が評価され、これらが AK 患者の臨床転帰と関連しているかどうかが決定されました。

2020年2月から10月にかけて、インド・ハイデラバードのLVプラサド眼科研究所（LVPEI）で、病院の記録と分離されたアカントアメーバ株に基づいて、病院ベースの遡及的症例シリーズ研究が実施された。この研究プロトコールは、LVPEIの治験審査委員会によって審査され、承認された。ハイデラバード (LEC-BHR-R-09–21-758)。 AK患者から回収された13のアカントアメーバ分離株がこの研究に含まれた。

研究期間中、施設のプロトコールに従って、微生物性角膜炎の臨床的特徴を示すすべての患者は、角膜上皮欠損、浸潤の大きさ（存在する場合）、下膿瘍の大きさ、強膜の関与を調査するために包括的な細隙灯検査を受けた。異物の有無と眼付属器の状態の記録[27]。角膜擦過傷の微生物学的調査には、グラム染色と水酸化カリウムを使用したカルコフルオロホワイト (KOH + CFW) マウントを使用した顕微鏡検査用の塗抹標本調製と、適切な培地 [5% 羊血液寒天 (BA)、チョコレート寒天 (CA)、サブロー] への接種が含まれます。デキストロース寒天 (SDA)、ポテトデキストロース寒天 (PDA)、大腸菌を含む非栄養寒天 (NNA)、チオグリコール酸ブロス、およびブレインハートインフュージョンブロス (BHI)]。すべての培地の塗抹と接種は、担当の臨床医によって細隙灯で行われました（標準どおり）。脱水培地はインド、ムンバイの HiMedia から供給され、使用のために社内で新たに調製されました。包帯コンタクトレンズ (2/13) を無菌的に小片に切断し、微生物研究所で BA、CA、SDA、NNA、および BHI に接種しました。 27℃のSDAおよびPDAと、5% CO2中で37℃でインキュベートしたチョコレート寒天を除き、すべての培地を37℃で好気的にインキュベートしました。培地の増殖を 14 日間観察しました。 13人の患者の角膜掻爬から分離されたアカントアメーバは、活性栄養型と二重壁多角形嚢胞の観察によって確認された。確認された分離株はNNAで保存され、オーストラリアのシドニーにあるニューサウスウェールズ州医学健康学部検眼・視覚科学学部に輸送されました。分離株の耐熱性は、28 °C、37 °C、40 °C、および 42 °C で分離株を増殖させることによって評価されました。最初の単離に続いて、アカントアメーバ株をペプトン酵母グルコース（PYG）培地中で無菌的に増殖させた[28]。各培養プレートを監視して、細胞外微生物や汚染が存在しないことを確認しました。汚染の可能性を防ぐために、栄養型が採取されるまで培地を2日ごとに新たに調製したPYGと交換した。さらに、この研究には 32 °C に設定された別の滅菌インキュベーターが使用されました。

アカントアメーバ株は、PCR アッセイによってさらに同定されました。 NNA 上で増殖させたアメーバ細胞を、滅菌スクレイパー (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を使用して 500 μL の 1X PBS (1.4 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4 および 1.8 mM KH2PO4、pH 6.9) に収集しました。ゲノム DNA (gDNA) は、0.1% v/v Triton X-100 (Sigma-Aldrich) および Tris 緩衝液、pH 8.0 (Thermo Fisher) 中の 10% v/v Chelex 溶解溶液 (Bio-Rad、カリフォルニア州、米国) を使用して抽出しました。 Scientific、ベッドフォード、米国）、以前に説明したように[29]。抽出された dsDNA の量は、Nano Drop UV-Vis 分光光度計 (Thermo Fisher Scientific) を使用して測定され、gDNA バイアルはさらに使用するまで -20 °C で保管されました。

18S rRNA の rns 遺伝子領域は、アカントアメーバ属特異的プライマー、JDPFw (5'-GGCCCAGATCGTTTACCGTGAA-3') および JDPRv (5'-TCTCACAAGCTGCTAGGGGAGTCA-3') を使用した PCR 反応で増幅されました。これらのプライマーは、非常に可変性の高い DF3 領域をコードしており、〜 450 bp のアンプリコン [30]。各 PCR アッセイは、12.5μL の DreamTaq マスターミックス (DNA ポリメラーゼ、2X DreamTaq バッファー、dATP、dCTP、dGTP、および dTTP: 各 0.4 mM、および 4 mM MgCl2; Thermo Fisher Scientific)、1μL の各プライマー (10 μM) 中で実行されました。、6.5μLの分子グレードの水と4μLのDNAテンプレート。 PCR 増幅は、96 ウェル T100 サーマルサイクラー (Bio-Rad、カリフォルニア、米国) で次のサーマルサイクリング条件を使用して実行されました: 初期変性のために 95 °C で 5 分間、続いて 35 サイクルの増幅 (変性のために 94 °C 30 秒、56 °C で 30 秒、72 °C で 45 秒）、最終伸長は 72 °C で 10 分間です [31]。 PCR増幅は、1%アガロースゲルにおける4μLのPCR産物アリコートの電気泳動によって観察され、アンプリコンバンドは、イメージラボソフトウェア（Bio-Rad）を備えたGel Doc XR +を使用して調べた。 PCR 陽性アンプリコンは、サンガー配列決定のためにラマシオッティゲノミクスセンター (UNSW、シドニー、オーストラリア) に送られました。 PCR産物はEXOSAP-ITキット(Thermo Fisher Scientific)を使用して精製し、3730 DNAアナライザー(Applied Biosystems,米国マサチューセッツ州）。

低品質のヌクレオチド配列は手動でチェックし、Chromas (2.6.6) ソフトウェア (Technelysium Pty Ltd、ブリスベン、オーストラリア) でトリミングしました [32]。トリミングされた配列リードは、NCBI ヌクレオチド配列データベース (BLASTn) でブラストされ、アカントアメーバの遺伝子型と種が同定されました。さらに、分離されたアカントアメーバ株は、Pussard と Pons の分類スキームに基づいて種に対して形態学的特徴付けが行われました [33]。確認および検証されたすべての配列リードは、GenBank 配列データリポジトリに送信されました。アカントアメーバ遺伝子型の公的に入手可能なヌクレオチド配列は、系統解析の参照株として NCBI から取得されました (追加ファイル 1: 表 S1)。配列は、ClustalW アルゴリズムを使用して整列され、系統樹は、MEGA-X の 1,000 個のブートストラップによって、最尤法と、Kimura-2 パラメーターを使用したベイジアンアプローチを使用して構築されました [34]。系統樹は、インタラクティブな生命の木 (iTOLv6) を使用して視覚化されました。 35]。

アカントアメーバは無菌的に増殖し、PYG (ペプトン酵母グルコース、pH 6.5) 中で維持されました [36]。すべての分離株を、PYG 培地 (500 μL/ウェル) を含む 24 ウェル培養プレートの別々のウェルに播種し、栄養型が各ウェルの底に 90% コンフルエントな層を形成するまで 28 °C で静的にインキュベートしました。 PYG のアリコートをトリプチケースソイ寒天 (Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) に接種し、37 °C で 48 時間インキュベートしました。インキュベーションの最後に、寒天プレートで細菌の増殖がないか検査されました。栄養型の収集前に、PYG 培地をゲンタマイシン (100 μg/mL) を含む PBS 1 mL に穏やかに交換して細胞外細菌を死滅させ、プレートを氷上に置き、穏やかに撹拌して付着した栄養型を取り除きました。 TRIzol 試薬 (Invitrogen、Life Technologies、ニューヨーク、米国) を、メーカーのプロトコールに従ってフェノール - クロロホルム分離法に従って全 gDNA 抽出に使用しました。この方法は、Mg2+ イオンを隔離することによって PCR アッセイに干渉する可能性がある EDTA の添加を排除するためにわずかに修正されました [37]。 gDNA の回収率を高めるために、TRIzol 処理した細胞懸濁液を 25G 注射針 (BD、ニュージャージー、米国) に 10 回通してアメーバ細胞を溶解しました。

細胞内細菌の 16S rRNA 遺伝子 (V4 領域) は、真正細菌 16S rRNA プライマーを使用して増幅されました。 515Fw/806Rv: Fw (5'- CCTACGGGNGGCWGCAG-3') および Rv (5' - GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') [38]。大腸菌 ATCC 10,798 のゲノム DNA とヌクレアーゼフリー水が、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールとして含まれました。細胞内真菌の存在は、18S および 28S rDNA の保存配列を標的とする真菌特異的なフォワード ITS1Fw (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') およびリバース ITS4Rv (5'-CCTCGCCTTTATTGATATGC-3') プライマーを使用して評価されました [39]。カンジダ・アルビカンスの臨床分離株を対照として含め、PCRアンプリコンのサンガー配列決定によって細胞内真菌を同定した。

細胞内の細菌または真菌を視覚化するために、共焦点顕微鏡法と組み合わせた FISH が以前のプロトコルに従って実行されました [40]。簡単に説明すると、無軸で増殖させた1 mlのアメーバ細胞（> 90%の栄養型）を1.5 mlのエッペンドルフチューブに収集し、3,000 gで5分間遠心分離して栄養型を回収しました。細胞ペレットを1×ページ食塩水で2回洗浄し、30μLのアメーバ懸濁液をポリ-L-リジンでコーティングしたスライド(Thermo Scientific、ブラウンシュヴァイク、ドイツ)に移し、周囲温度で30分間放置した。接着細胞は、新たに調製した 4% ホルムアルデヒド (緩衝、pH 6.9) 30 μL を 25 分間適用することによって固定されました。付着したアメーバ細胞を 1X PBS で洗浄し、エタノール濃度を増加させて (50%、80%、および 96%、それぞれ 3 分間) 脱水し、風乾しました。細胞内細菌は、Cy3 標識細菌ドメイン特異的プローブ EUB338 [41] を使用したハイブリダイゼーションによって検査され、真菌は Hex と結合した真菌特異的プローブ PF2 および真核生物 18S rRNA 用の Cy5 標識 EUK516 プローブ (表 1) [42] を使用して検査されました。、ウルム、ドイツ）。各プローブのアリコート (50 ng/μL の 1 μL) を 9 μL のハイブリダイゼーションバッファー (20 mM Tris-HCl、pH 7.1、900 mM NaCl、および 20% v/v ホルムアミド、0.01% SDS) と混合し、固定液に添加しました。スライド上のアメーバ細胞。ハイブリダイゼーションは暗所で 46 °C で少なくとも 90 分間実行し、その後スライドを 20 µL の予熱 (48 °C) 緩衝液 (180 mM NaCl、20 mM Tris/HCl、pH 7.2、および 0.01%) でリンスしました。 SDS）。次に、スライドを 200μL のバッファーで覆い、48 °C で 25 分間洗浄ステップを実行しました。すべてのスライドを氷冷した MilliQ 水に素早く浸し、風乾し、Prolong Diamond Antifade with DAPI (Thermo Fisher Scientific) を使用してマウントし、マウントしたスライドをイメージング前に暗所で室温で一晩放置して硬化させました。 3 つの独立したアッセイが実行され、少なくとも 30 個のアメーバ宿主細胞が UNSW のカタリーナガウス光学顕微鏡施設のオリンパス FV1200 共焦点レーザー走査顕微鏡で視覚化され、FISH 画像が ImageJ で分析されました [43]。

13 人の AK 患者全員の人口統計学的特徴と臨床的特徴が、病院の記録からカスタマイズされたデータシートで取得され、次の特徴について検討されました。報告された症状; 浸潤物および上皮欠損の期間、サイズおよび特徴（一部の測定値は臨床画像から転写された）。事前の治療（LVPEIで患者を最初に来院する前に使用された薬剤と定義される）。 LVPEI での臨床治療計画と治療期間。手術の必要性。治療結果。患者の職業。 AK の危険因子も報告されています [45]。

データ分析は、SPSS ソフトウェアバージョン 26.0 (SPSS, Inc.、イリノイ州シカゴ) で実行されました。割合はパーセンテージとして表示され、連続データの平均±標準偏差が計算されました。人口統計データと臨床データの 95% 信頼区間 (CI) は、比率 (p) ± 1.96* SEM (平均の標準誤差) を使用して計算されました。フィッシャーの直接確率とカイ二乗は、両側検定の P 値 < 0.05 の有意水準で、内部共生状態に関する人口統計データと臨床データを比較するために使用されました。

13 人の AK 患者のうち、最も多くの症例数 (30.8%、4 人の AK 患者) が 2 月に観察されました (追加ファイル 1: 図 S1)。患者はインドの6つの異なる州の出身でした。 5人はテランガーナ州、3人はマハラシュトラ州、2人はアーンドラ・プラデーシュ州、そして1人はラジャスタン州、ウッタル・プラデーシュ州、トリプラ州であった（図1）。

インドの AK 患者と LVPEI 病院の州を示す地図。マップは ArcGIS (Esri GIS、カリフォルニア州、米国) を使用して作成されました。 AP アーンドラプラデーシュ州、マハーラーシュトラ州、RA ラジャスタン州、TE テランガーナ、TR トリプラ、UP ウッタルプラデーシュ州

アカントアメーバ株の同定とさまざまな温度での増殖を表 2 に示します。7 つの分離株 (53.8%) が 40 °C および 42 °C で増殖し、AK を引き起こす特定の株の耐熱性が実証されました。図 2 は、アカントアメーバ分離株 (L-2483/20) の栄養型 (1A および 1B) およびシスト (1C-1E) を示しています。図 3 は、アメーバ 18S rDNA 遺伝子の DF3 領域と細菌 16S rRNA の PCR 産物のアガロースゲル画像を示しています。すべてのアメーバはアカントアメーバであることが確認され、そのうち 8 株 (61.5%、8/13) には細胞内細菌が存在し、1 つの分離株 (L-2429/20) には真菌が含まれていました。トリプチケースソイ寒天上で培養した PYG アリコートからは細菌は増殖しなかった。このことは、FISH 実験で同定された細菌はいずれも細胞内に存在する可能性が非常に高いことを示唆している。

アカントアメーバ栄養型の構造 (A) 有棘足を持ち、矢印は細胞表面の針状の突起を示します。 B、DAPIで染色した栄養型の核の共焦点画像。 C、D、プレシスト（C、D）から二重壁の多角形シスト（E）までのL-1326/20株のシストメントの段階、矢印は多角形のアカントアメーバシストを示します。スケールバー、10 μm

アカントアメーバ分離株および細胞内細菌の PCR アンプリコンのトリミングされたアガロースゲル画像。バンドは 1% ゲル電気泳動を使用して視覚化されました。プライマーペア JDPFw/Rv および 515Fw/806Rv は、それぞれ約 450 bp および約 293 bp のアンプリコンを生成しました。 A. Castellanii (ATCC 30868) および E. coli (ATCC 10798) を 18S rRNA および 16S rRNA PCR 反応のポジティブコントロールとして使用し、ヌクレアーゼフリー水をネガティブコントロールとして使用しました。フルサイズのゲル画像は追加ファイル 1 に含まれています (図 4 および 5)。

アカントアメーバ分離株の 18S rRNA 配列から推定された系統樹。このツリーは、1,000 回の反復ブートストラップ値に基づいて、Kimura 2 パラメーターを使用した隣接結合アプローチを使用して作成されました。この研究のアカントアメーバ分離株（青色）は、2 つの主要な遺伝子型クレードを形成しました。 T4 が主要な遺伝子型 (3 つのサブクラスター: T4A、T4B、および T4F) であり、T12 には 1 つの分離株しかありませんでした。「*」は NCBI 参照種および遺伝子型を示します (紫色)

アカントアメーバ分離株の細胞内細菌 A と真菌 C を示す FISH アッセイの代表的な画像。桿菌は集団内のすべてのアメーバ細胞全体に分散しており、EUB338 プローブ (L-579/20、赤い矢印で示す) を使用して検出されました。 B 細胞内細菌や真菌を含まないアカントアメーバ栄養体 (L-552/20)。 C PF2 プローブ (L-2429/20、黄色の矢印で示す) を使用して、アカントアメーバ株内で大きな卵形の真菌細胞が観察されました。スケールバー、12 μm

アメーバル 18S rDNA DF3 領域の部分ヌクレオチド配列は、ClustalW アルゴリズムを使用してアラインメントされ、最も高い株間ヌクレオチド配列変異を示しました (追加ファイル 1: 図 S2)。 13 の分離株の隣接結合系統解析により 2 つの主要なクレードが形成され、ほとんどの分離株 (12/13、92.3%) は遺伝子型 T4 (L-552/20、L-1133/20、L-1257/20、L-) に属していました。 2482/20、L-2483/20、L-2487/20: A. culbertsoni; L-579/20、L-1326/20: A. ポリファーガ; L-1137/20、L-2429/20: A. triangaliis、L-604/20、L-1765/20: Acanthamoeba spp. T4)、および遺伝子型 T12 の 1 つの分離株 (L-2391/20) (A. heelyi; 表 2 および追加ファイル 1: 表 S2)。嚢胞の形態とともに、アカントアメーバの既存の種および遺伝子型の NCBI の配列と最も高いアラインメント (同一性%) をもたらす配列が各分離株に割り当てられました。 2 つの分離株 (L-604/20 および L-1765/20) では、アカントアメーバの特定の種では嚢胞の形態は明らかではありませんでしたが、NCBI ヌクレオチドブラスト法により系統解析により両株が遺伝子型 T4 に属することが確認されました。遺伝子型 T12 は、眼外傷の病歴のないマハラシュトラ州の農家から検出されました。同じ州の他の2人の感染者は遺伝子型T4に感染していた。残りの 10 株の T4 変異株は、アンドラプラデーシュ州、ラジャスタン州、テランガーナ、トリプラ、ウッタルプラデーシュ州の AK 患者から回収されました (追加ファイル 1: マップ S1)。優勢な T4 クレードでは、分離株は 3 つのサブクラスター、T4A (分離株 1 株)、T4B (分離株 10 株)、および T4F (分離株 1 株) を形成しました。 13 の分離株すべてのヌクレオチド配列は、アクセッション番号 OK042094 ～ OK042106 で GenBank に寄託されています (表 2)。遺伝子型 T4B のうち、6 人の患者が A. culbertsoni に感染し、2 人が A. ポリファーガに、1 人が A. トライアングルリスまたはアカントアメーバ属に感染しました。 1人の患者はT12 A. heelyiに感染しており、もう1人の患者（L-1765/20）はT4A Acanthamoeba spp.に感染していた。 (図4)。

アカントアメーバ分離株 13 株のうち、9 株（69.2%）は細胞内微生物陽性であり、8 株は細菌を保有しており（図 3）、1 株はマラセチアレストリクタという真菌を保有している（L-2429/20）（追加ファイル 1：図 S3）。細菌を保有する 8 つの分離株では、棒状の細胞内細菌が細胞質全体で観察され、この細菌は観察された集団のすべてのアカントアメーバ細胞に存在していました。プロトコールにより予想されたように、細胞外細菌は観察されませんでした。 M. レストリクタは、アカントアメーバ分離株内で楕円形の緑色細胞として見られました (図 5)。

細胞内細菌または真菌を伴うアカントアメーバに感染したAK患者の平均症状持続期間は、内部共生生物を含まないアカントアメーバに感染した患者の16.5±5.1日と比較して、43.0±44.3日であった（表3）。これら 9 人の AK 症例のうち、6 人には眼外傷 (n = 4) またはコンタクトレンズ装用 (n = 2) の病歴があり、3 人は農民でした。アメーバ内部共生生物の存在下では、間質浸潤（88.9%、8/9）および下膿瘍（55.6%、5/9）を伴う重症型のAKが認められ、5例が間質浸潤と下膿瘍の両方を有していた。しかし、間質浸潤（p = 0.2）と下膿瘍（p = 1.0）におけるこれらの違いは、内部共生生物を持たない患者と比較して、アメーバ型内部共生生物を有する AK 患者において有意に一般的ではありませんでした。興味深いことに、アカントアメーバ内部共生生物を持たない患者では、より長い治療期間（中央値、IQR：75.0、43.5～202.5日対30.0、17.0～91.8日）が観察されました（p = 0.2）。内部共生生物が存在する場合、潰瘍が治癒した患者の割合（66.6%）または最終的なVAが改善した患者の割合（44.4%）は、内部共生生物が存在しない患者（それぞれ75%および50%）と比較して低かった（p > 0.05）。内部共生細菌を伴うアカントアメーバに感染した2人の患者（25％、2/8）は、抗アメーバ薬とともに抗生物質の投与を受けており、両方の患者の潰瘍は投薬後に解消した。

AK 患者のほとんどは農民 (5/13) または学生 (5/13) であり、報告されている AK に関連する危険因子は眼の外傷 (4 例; 30.8%; 95% CI = 9.1-61.4) とコンタクトレンズの装用 ( 2 例; 15.4%; 95% CI = 1.9-45.5)。片側性 AK は 12 例 (92.3%) で報告されました。 AK 患者の大部分は、主な症状として視力低下 (84.6%) を有し、続いて目の痛み (69.2%)、発赤 (69.2%)、流水 (53.8%)、角膜の白点 (15.4%) でした。典型的な AK 特徴的なリング浸潤 (> 4 mm) が 3 例 (23.1%) で観察されました。上皮欠損は6例(46.2%; 6.2±1.7mm)、間質浸潤は10例(76.9%; 5.0±2.2mm)、および下膿瘍は6例(46.1%; 1.12±0.6mm)で認められた。症状発現期間の中央値は20日（IQR = 15～30）で、農業背景を持つ患者（5/5、100%）、年齢＞32歳（4/6）では最終視力が2ライン以上改善しなかった。、80%）、および 20 日以上 AK 症状を示している患者（3/6、50%）（追加ファイル 1: 表 S3）。この研究では、PHMB とクロロヘキシジンが最も一般的な治療法でした (11 例、84.6%)。支持療法として、3 例に抗生物質、1 例に抗ウイルス剤、1 例に抗真菌剤が投与されました (38.5%)。これらの症例では、PHMB とクロロヘキシジンのみで治療した症例と比較して、最終診察時の BCVA に改善はありませんでした (p > 0.05)。全体として、治療期間の中央値は 38 日 (IQR = 23 ～ 90) でした。外科的治療を受けた 6 例のうち、4 例は治療的全層角膜形成術 (TPK、n = 4) を受け、1 例は羊膜移植を受けました (表 4)。残りの2例のうち、1例はローズベンガルによる光力学抗菌療法（RB-PDAT）を受け、1例は内臓摘出を受けた。眼科手術を受けなければならなかった6人の患者のうち、66.7％（6人中4人）が細胞内細菌を持つアカントアメーバ株に感染していた。

アカントアメーバ属の 13 の臨床分離株。インドのハイデラバード出身の患者の遺伝子型が特定され、AK 患者に関連する臨床症状が分析されました。世界中で報告されているように、T4 が最も一般的な遺伝子型 (92.3%) でした [45、46、47、48]。 A. culbertsoni (6、46.2%) は T4 遺伝子型の中で優勢な種であり、これはインドで以前に報告されています [45]。既存の危険因子のない患者から回収された 1 つの分離株は、AK 症例からはまれに分離されるクレード T12 に属していました [19]。

現在の研究は、T4遺伝子型を引き起こす主な角膜炎がインドの複数の州（アーンドラ・プラデーシュ州、マハーラーシュトラ州、ラジャスタン州、テランガーナ州、トリプラ州、ウッタル・プラデーシュ州）でも蔓延していることを裏付けている。著者の知る限り、これはインドにおける角膜感染症による A. heelyi T12 遺伝子型の報告としては 2 件目です [45]。遺伝子型 T12 によって引き起こされる重篤な AK 症例がタイのバンコクから報告されています [19]。患者には腐食性化学物質への曝露歴があり、感染した目を洗うために水道水を使用していました。 T4 株 (92.3%、12/13) のうち、大多数は T4B (83.3%、10/12) であり、T4A と T4F がそれぞれ 1 株ずつ分離されました。以前のインドの研究では、26株のT4Bサブクラスターのうち13株(50%)が報告され、その他はT4A(2株)、T4D(10株)、T4E(1株)であった[45]。 T4A (38%) はチリの AK 患者から回収されたアカントアメーバ分離株の主要なサブ遺伝子型で、T4B、T4G、T4C、T4D がそれに続きました [46]。 T4 株の中でも、角膜感染症に関連する T4E、F、G、I、J、N、O、P、V、X などの他の DF3 変異体がさまざまな国から報告されています [46、49、50]。これらの発見は、AK を引き起こす T4 分離株間の地理的な違いを示唆していますが、これにはさらなる調査が必要です。

AKの発生率は世界中で着実に増加しており、先進国では症例の約90%がコンタクトレンズに関連している[49]。インドやその他の発展途上国では、コンタクトレンズの着用とAKは一般的に関連付けられていませんが、[45,51]世界的な近視の急増と、近視の予防、美容目的、スポーツ活動のためのコンタクトレンズの使用により、特にAKのリスクが増加しています。若者の間で[1]。現在の研究で観察されているように、眼の外傷と汚染された土壌や水との接触は、コンタクトレンズの装用とは関係のないAK感染の主要な素因危険因子である[52,53,54]。中国中部(52.1%) [55] と南インド(48.7%) [52] では、粉塵粒子または植物物質による眼損傷が最も一般的に報告された危険因子であった。

最終的な VA は、農家 (100%)、32 歳以上の患者 (80%)、角膜炎の症状が 20 日以上続いた症例 (50%) では 2 系統以上改善されませんでした。英国の研究でも、34歳以上のAK患者の最悪の臨床転帰が報告されている[56]。角膜の完全性は年齢とともに弱くなり、高齢者におけるドライアイの発生率が高いことが、重度の AK の素因となっている可能性があります [9]。 LVPEI による細菌性角膜炎に関する以前の研究は、現在の研究で見出された上皮欠損サイズと VA 損失との関連性を裏付けています [57]。患者の職業は危険因子と関連していることが多い[55]。現在の研究では、農業背景を持つ5人の症例のうち、4人（80％）はフレーマーが屋外活動に頻繁にさらされているため、非滅菌の外部物質によって引き起こされた可能性のある眼外傷の病歴を有しており、患者3人（75％、3/ 5) アカントアメーバ株に細胞内細菌を感染させた。 4例とも眼科手術を受けなければならなかったが、術後の回復後も視力は改善しなかった。汚染された物体による眼の外傷は、アカントアメーバ細胞の侵入の理想的な媒体となり、重篤な AK を引き起こす可能性があります。中国南部では、眼損傷の病歴を持つAK患者の約90%が視力を回復するために角膜移植を受けていた[58]。

13 株のアカントアメーバ分離株のうち、8 株 (61.5%) が細胞内細菌を保有していました。これは、米国の研究 [25] で細胞内細菌を保有していたアカントアメーバの 59.4% と非常に似ていますが、アメリカの株よりも 2 ～ 3 倍多かったです。 Type Culture collection [26]、または細胞内微生物を明らかにするために伝統的な染色技術のみを使用した米国の古い研究 (1993) [59]。シュードモナス属、レジオネラ属、クラミジア属、およびマイコバクテリウム属に属する細胞内細菌が、米国の AK 症例から回収されたアカントアメーバ分離株から検出されている [25]。ヒトの鼻腔スワブ、角膜、湖の堆積物からそれぞれ分離された ATCC 株で検出されました [26]。フリッチェら。 [59] は、さまざまな場所のアカントアメーバの環境株 (24%) と臨床株 (26%) の両方で桿菌および球菌の形をした細菌を観察しました。アカントアメーバ細胞内では系統発生的に多様な細胞内微生物の共発生が観察されている[60]。イランのアカントアメーバの臨床分離株から、アスペルギルス種、緑膿菌、およびHAdV（ヒト・アデノウイルス）が検出された[61]。私たちの知る限り、これは M. Restricta をアカントアメーバの内部共生生物として記載した最初の報告です。患者は化学薬品による眼外傷の既往歴のある農家で、PHMBとクロルヘキシジンを1か月間使用した治療でも角膜潰瘍は解消しなかった。 AK患者におけるアカントアメーバとマラセチアの同時感染は報告されていないが、M. レストリクタが真菌性角膜炎を引き起こすことはまれである[62]。他の研究では、アカントアメーバとクラドスポリウム、フザリウム、カーブラリアなどの真菌の同時感染による角膜炎が報告されています[23、63、64]。

臨床研究と細胞モデルで示されているように、アカントアメーバの細胞内細菌は角膜上皮の損傷を増強する可能性があります[25]。今回の研究では臨床症状に有意差はなかったが、細菌の内部共生生物の存在は、間質浸潤（87.5％）、上皮欠損（62.5％）、および膿疱症（50％）のより高い割合と関連していた。現在のデータに基づいて、これらの違いの有意な効果を示すために、最低 54 人の被験者 (2 つの独立した比率間の差の Z 検定; α 誤差 = 0.05、1-β 誤差 = 0.8、Z スコア = 1.95、および配分比 = 1:1) は今後の研究で必要になります (G*Power v3.1.9.7)。

現在の研究では、内部共生細菌を伴うアカントアメーバの影響を受けた2例（25％、2/8）が抗生物質（シプロフロキサシンとドキシサイクリン）と局所抗アメーバ薬の投与を受けており、両例の潰瘍は治療後に解消した。細胞内細菌を伴う残りの AK 症例は、PHMB とクロルヘキシジンのみで治療した場合に治癒しました。これらの消毒剤は細菌に対しても効果があるため、これは予想されます [65]。抗生物質の追加は、細胞内細菌の毒性を増強する形質を無効にするための抗アメーバ化学療法に有利である可能性がある[26]。一方、損傷した角膜におけるアメーバ宿主の死後、内部共生生物が放出されると、炎症が促進され、臨床転帰が悪化する可能性があります。現時点では、抗生物質などの抗アメーバ治療に対する補助療法が、抗アメーバ薬単独と比較して有効であるかどうかは十分に理解されておらず[66]、アメーバ感染時の内部共生生物の役割もまだ十分に研究されていない[25]。現在の研究のサンプルサイズは、これら 2 つのグループ間の臨床的に有意な差を評価するには不十分である可能性があります。しかし、パイロットデータを用いたベースライン研究として、この研究はアカントアメーバ角膜炎の疫学的および分類学的目的にとって価値があります。宿主の病原性、薬物感受性、臨床転帰に対するアメーバ内部共生生物の影響、および標準的な抗アメーバ化学療法への抗菌アジュバントの追加の利点を、より高いコホートおよびAK患者の長期追跡調査で調べるには、今後の研究が必要である。

この研究により、角膜炎を引き起こすアカントアメーバ分離株は主に T4 遺伝子型で、次に T12 であり、主要な T4 遺伝子型内に 3 つのサブゲノム変異体 T4A、T4B、および T4F が同定されたことが確認されました。アカントアメーバの種および/または遺伝子型と患者の臨床転帰との間に有意な関連はありませんでした。今回の研究では、内部共生生物を有するアカントアメーバ株が多数観察され、臨床転帰との明確な関係はなかったものの、アカントアメーバ内部共生生物はアメーバ宿主の病原性、生存、薬剤感受性の形成に関与している可能性がある。

AK 患者の臨床データは Excel および SPSS シートで入手でき、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。割り当てられたヌクレオチド配列の GenBank アクセッション番号は OK042094 から OK042106 の範囲でした (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=OK042094:OK042106[accn])。

アカントアメーバ角膜炎

アカントアメーバ特異的アンプマー

最高矯正視力

デオキシヌクレオシド三リン酸

診断フラグメント 3

LV プラサド眼科研究所

ポリヘキサメチレンビグアナイド

核小サブユニット 18S リボソーム RNA 遺伝子

無栄養寒天

蛍光 in situ ハイブリダイゼーション

ポリメラーゼ連鎖反応

ローズベンガルの光力学抗菌療法

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アカントアメーバ株と AK 患者の臨床データを提供してくださったインド、ハイデラバードの LVPEI の貢献に感謝いたします。 BR は博士号取得のために授業料奨学金 (UNSW、シドニー) を受給しており、これによりこの研究は完了しました。

この研究の暫定要約は、2021年6月20日～24日開催の世界微生物フォーラム（バーチャル）および2021年5月31日～6月3日開催（バーチャル）のオーストラリア微生物学会年次学術会議でポスタープレゼンテーションとして発表されました。

この研究には資金提供はなかった。

ニューサウスウェールズ州、オーストラリア、シドニー、医学健康学部検眼・視覚科学学部

ビノッド・ラヤマジー、マーク・ウィルコックス、ガウリ・シャンカール・シュレスタ、ニコール・カーント

ジャベリ微生物学センター、ブライエン・ホールデン教授眼研究センター、ハイデラバード眼科研究財団、LVプラサド眼科研究所（LVPEI）、カラム・アンジ・レディ・キャンパス、ハイデラバード、インド

サビトリ・シャルマ

西スコットランド大学 (UWS) 生物医学環境健康研究研究所、健康生命科学部、ペイズリー、PA1 2BE、スコットランド、英国

フィオナ・L・エンリケス

角膜研究所、LV プラサド眼科研究所、バンジャラヒルズ、ハイデラバード、インド

ラクシース・ネイサン・ラジャゴパル & ブペシュ・バッガ

モナシュ大学生物科学部、クレイトン、VIC、3800、オーストラリア

ディネシュ・スベディ

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この原稿はすべての著者の貢献によって書かれました。研究の概念化とデザイン: NC、MW、FLH、BR、SS。アカントアメーバ株コレクション: SS; 臨床データ抽出: SS、RN、BB; 臨床データ分析: GS、BR; 実験室調査とデータ分析: BR、DS、MW、FLH、NC; 執筆：原案作成：BR; レビューと編集: MW、NC、FLH、GS、DS、SS、RNR。監修：NC、MW、FLH、SS 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ビノッド・ラヤマジーへの通信。

この研究プロトコールは、ハイデラバードのLVPEIの治験審査委員会によって審査され、承認されました（LEC-BHR-R-09–21-758）。十分な情報に基づいた書面による同意がすべての参加者から得られました。この研究は、ヘルシンキ宣言に概説されている倫理原則とガイドラインに従って実施されました。

適用できない。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

この研究で系統解析のために使用した参照アカントアメーバ株。表 2: AK 患者から回収されたアカントアメーバ分離株の遺伝子型と種の同定。地図 1: インドのさまざまな州の AK 患者の状態を示す地図。サンプルコードと AK 患者から採取されたアカントアメーバの遺伝子型が特定されました。マップは ArcGIS (Esri GIS、カリフォルニア州、米国) を使用して作成されました。図S1。研究期間中のAK症例の月次分布。図S2。 ClustalWを使用したアカントアメーバ18S rDNA DF3領域の配列アラインメント。表S3。アカントアメーバ属に感染した角膜炎患者の全体的な臨床症状。図S3。真菌の 18S (ITS1) rDNA 配列から推定された系統樹。ツリーは、1000 回の反復ブートストラップ値に基づいて、Kimura 2 パラメーターを使用した隣接結合アプローチを使用して作成されました。図S4。 13 個のアカントアメーバ分離株 (18S rRNA) の PCR アンプリコンのアガロース (1%) ゲル画像。アカントアメーバ属特異的プライマーペア JDPFw および JDPRv を使用して PCR アッセイを実行し、約 450 bp アンプリコンが得られました。図 S5: 細胞内細菌 16S rRNA、プライマーペア 515Fw および 806Rv (V4、16S rRNA) をターゲットとする 13 種類のアカントアメーバ分離株の PCR アンプリコンのアガロース (1%) ゲル画像。これにより、約 293 bp アンプリコンが得られました。

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転載と許可

Rayamajhee、B.、Sharma、S.、Willcox、M. 他。眼感染から回復したアカントアメーバの遺伝子型、内部共生生物および臨床的特徴の評価。 BMC Infect Dis 22、757 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s12879-022-07741-4

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受信日: 2022 年 5 月 5 日

受理日: 2022 年 9 月 12 日

公開日: 2022 年 9 月 29 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12879-022-07741-4

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