黄色ブドウ球菌キャリアおよび非キャリアにおけるムピロシン治療後の鼻マイクロバイオームの破壊と回復

Scientific Reports volume 12、記事番号: 19738 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

日和見病原体である黄色ブドウ球菌に対する鼻腔の除菌処置は、局所抗菌薬の使用に依存しているが、鼻腔微生物叢への影響は十分に理解されていない。私たちは、健康な黄色ブドウ球菌キャリアと非キャリアにおけるこの影響を調べました。これは、鼻ムピロシンおよびクロルヘキシジン浴で治療された8人の黄色ブドウ球菌キャリアと8人の非キャリアを対象とした前向き介入コホート研究である。 6 か月にわたって連続的に鼻腔スワブを採取しました。黄色ブドウ球菌は定量培養によって検出され、スパタイピングを使用して遺伝子型が特定されました。 RNA ベースの 16S 種レベルのメタバーコーディングを使用して、生きている微生物の多様性を評価しました。 Dolosigranulum pigrum、Moraxella nonliquefaciens および Corynebacterium propinquum 種は、黄色ブドウ球菌の保菌と負の相関がありました。ムピロシン処理は、黄色ブドウ球菌、ピグラム D. および M. ノンリケファシエンスを効果的に除去しましたが、コリネバクテリアは除去しませんでした。保因者における黄色ブドウ球菌の再定着は、非保因者における優勢種による再定着よりも迅速に発生した（それぞれ中央値3か月対6か月）。再定着した黄色ブドウ球菌分離株のほとんどは、最初の分離株と同じスパタイプを持っていました。鼻微生物叢に対するムピロシン-クロルヘキシジン治療の影響は、6か月後でも検出可能でした。黄色ブドウ球菌の再定着は微生物叢の回復よりも前であり、この病原体の鼻ニッチへの強い適応と定着除去手順の一時的な有効性が強調されています。

黄色ブドウ球菌は日和見病原体であり、重篤な感染症の原因となることがよくあります。一般人口の約 20% が持続性黄色ブドウ球菌保菌者であり、さらに 30% が間欠性黄色ブドウ球菌保菌者です1。黄色ブドウ球菌は通常、鼻に感染しますが、喉、皮膚、会陰に感染することはあまりありません1。

黄色ブドウ球菌キャリアは、侵襲的処置や手術後の感染リスクが高くなります2,3。感染を防ぐために、いくつかの国では、リスクのある介入の前に、除菌手順を使用して鼻から黄色ブドウ球菌を除去することを推奨しています4。これには通常、ムピロシン鼻軟膏による局所抗菌治療が含まれ、クロルヘキシジンの皮膚洗浄および洗髪を併用する場合と併用しない場合があります。医療におけるコストと組織上の問題により、さまざまな脱植民地化アプローチが登場しています5。リスクのある介入を受けているすべての患者を治療するようアドバイスする人もいますが、感染が確認された保菌者のみに感染除去を制限する人もいます。

鼻の微生物叢の構成が黄色ブドウ球菌の存在に関連していることはわかっていますが、除菌手順が鼻の微生物叢に及ぼす影響はまだ完全には理解されていません。以前の鼻のマイクロバイオーム研究では、黄色ブドウ球菌保菌は、クチバクテリウム・アクネ、コリネバクテリウム・アコレンス、および非黄色ブドウ球菌の相対存在量がより高く、コリネバクテリウム・シュードジフテリティクム、ドロシグラヌラム種の相対存在量がより低いことと関連していた。およびCutibacterium granulosum6,7。これらの関連性は、鼻内の微生物種の分布が、おそらく栄養素や上皮結合部位の競合を通じて、黄色ブドウ球菌の存続に影響を与えることを示唆しています8。同様に、除菌手順後の微生物分布の変化は、持続的な黄色ブドウ球菌の再定着の可能性、および臨床的観点からは除菌失敗の可能性に影響を与える可能性があります。しかし、脱植民地化後の微生物叢の変化の規模と期間は解明されていません。これまでのところ、単一患者のマイクロバイオーム研究では、ムピロシン治療後の鼻の微生物叢の組成と生物多様性の変化が発見されており9、健康なボランティア5名を対象とした以前のカルチュロミクス研究では、1ヶ月まで微生物叢の豊富さと多様性に有意な変化が見られなかったのとは対照的である。脱植民地化後10.

黄色ブドウ球菌の鼻腔保菌、鼻腔微生物叢、および除菌手順との関係を解読するために、我々は、黄色ブドウ球菌の保菌者と非保菌者を対象とした前向き介入コホート研究を実施し、ムピロシン・クロルヘキシジン治療後6か月にわたる微生物群集の変化をモニタリングした。定量的培養と 16S メタバーコーディングを使用して、細菌群集に対するコロニー除去の影響と、黄色ブドウ球菌および他の優占種の再コロニー形成の遅延を調べました。

ボランティア 35 名のうち、保因者 8 名と非保因者 8 名が含まれました (図 1 の患者選択のフローチャートを参照)。黄色ブドウ球菌キャリアグループは、22～71歳（中央値26歳）の男性3名、女性5名で構成されていました。非キャリアは、18～62歳（中央値56歳）の男性2名、女性6名であった。研究前または研究中の 3 か月間に、抗ウイルス薬、抗寄生虫薬、免疫抑制薬、またはプロバイオティクスの使用を報告した参加者はいませんでした。非保因者 1 人は、D0 サンプリングの 5 日前と、M3 と M6 サンプリングの間にもアモキシシリン/クラブラン酸の使用を報告しました。この参加者は、抗菌薬の使用がリクルート後に発生し、微生物叢の組成が除菌前の他の非キャリアと変わらなかったため、維持されました。以前に MRSA 保菌を報告した参加者はいなかった。 16 人の参加者全員が、黄色ブドウ球菌感染の少なくとも 1 つの危険因子を持っていました (補足表 1)。

参加者募集の流れ。合計 35 人のボランティアが募集され、資格があるかどうか審査されました。 16 人の参加者が研究を完了し、そのうち 8 人が保因者、8 人が非保因者でした。

脱コロニー化処理後の黄色ブドウ球菌の排除と再コロニー形成の動態を、定量培養 (図 2A) および RNA メタバーコーディング (図 2B) を使用して調べました。どちらの方法でも、脱コロニー化直後に黄色ブドウ球菌の負荷が急激に減少し、その後、一部の保因者が再コロニー化したことを示す徐々に増加することが示されました。 1 つのキャリアでの除菌の失敗は、両方の方法で最初の除菌後のサンプルで確認されました (図 2)。再コロニー形成は、コロニー除去後の黄色ブドウ球菌陽性培養物 (> 8 CFU/mL) として定義されました。フォローアップ期間中に 5 つの保菌者 (C1、C2、C5、C6、および C7) が再定着しました。このうち 3 つの保菌者は脱植後 1 か月以内に発生しました。非キャリアグループでは、脱コロニー化後に 4 つの黄色ブドウ球菌陽性培養物が見つかり、そのうち 3 つは 1 CFU/mL のみでした。

脱コロニー化中のキャリアおよび非キャリアの鼻サンプルにおける黄色ブドウ球菌の存在量の動態。定量培養における黄色ブドウ球菌の存在量 (対数スケールでの CFU/ml; A) と、キャリア 8 名 (赤) および非キャリア 8 名 (青) における経時的な 16S RNA メタバーコーディングの割合 (B) を示します。 D0 と D7 はそれぞれ、脱植民地化手順の直前と直後に採取されたサンプルを示します。破線は各参加者のデータを示します。実線と色付きの帯は平均値と 95% 信頼区間を示します。培養分析とメタバーコーディング分析の両方で、脱コロニー化とそれに続く再コロニー化後の黄色ブドウ球菌の存在量の急激な減少が確認されました。平均して、脱植民地化後の黄色ブドウ球菌の存在量は、脱植民地化前よりも減少しました。

RNA メタバーコーディングでは、異なる再コロニー形成結果が示されました。 5 つのキャリア (C1、C2、C3、C5、および C8) も RNA メタバーコーディングに従って再コロニー化されましたが、4 つのキャリア (C3、C6、C7 および C8) では不一致が見つかりました。 2 人のキャリア (C5 および C8) については、RNA メタバーコーディングは培養陽性なしでも再コロニー形成を示しました。別の2人のキャリア(C6およびC7)は、培養陽性にもかかわらず、RNAメタバーコーディングにおける再コロニー形成を示さなかった。

培養液中で黄色ブドウ球菌の再定着を示す保菌者において、スパのタイプを決定しました（n = 5）。再定着した黄色ブドウ球菌保菌者は 1 名を除くすべてで、定着前および除菌後のサンプルで同じスパタイプを示しました。 2 つの保菌者では、異なるスパタイプが見つかり、脱コロニー化前の保菌株とは異なる株による一時的な定着が示唆されました。スパタイピングの結果を表1に示します。再コロニー化遅延とCFU / mL負荷の詳細を補足図1に示します。試験した分離株ではメチシリンに対する表現型耐性は見つかりませんでした。

全体として、黄色ブドウ球菌の除菌は 6 か月間にわたってわずか 3 人の参加者 (38%) で成功し続けました (図 2 および補足図 1)。これは以前の所見と一致しています。興味深いことに、メタバーコーディング手法では、いくつかの非保因者において、コロニー除去後 2 日および 1 か月後に、小さな割合（約 1 ～ 5%）の黄色ブドウ球菌の読み取り値が検出されました（図 2B）。これは、黄色ブドウ球菌分離株による鼻ニッチへの一時的な侵入を反映している可能性があり、抗生物質誘発性撹乱後の腸内微生物叢で説明されているように、脱コロニー化によって誘発された鼻微生物叢の破壊によって促進された可能性があります 12。この断続的な保菌は正常な人でも予想されることです。

コロニーを除去する前に、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ピグラム菌、モラクセラ・ノンリケファシエンス、アクネ菌、およびコリネバクタリア属の4種を含む、鼻微生物叢の9つの主要な細菌種が特定されました（図3A、C。補足の各参加者の詳細を参照）図2）。前鼻孔で見られる一般的な分類群である D. pigrum は、非保因者に特に豊富に存在し、蔓延していました。 C. propinquum は両方のグループに存在し、非キャリアの方が平均して 15% 多かった。黄色ブドウ球菌および表皮ブドウ球菌、D. ピグラムおよび M. ノンリケファシエンスを含むムピロシン感受性種は、除菌後に細菌叢から実質的に除去されましたが、ムピロシン耐性のコリネバクテリアおよび C. アクネ菌は依然として豊富に存在しました 13,14。脱コロニー化後、キャリアではなく非キャリアにおける C. pseudodiphteriticum の平均割合は 7 日後に 10 倍に増加し、表皮ブドウ球菌の割合は 1 か月後には 10 倍に増加しました。他の時点では、C. pseudodiphteriticum と S.epidermidis の平均割合は、保因者と非保因者で同等でした。 10％を超えるD. pigrumが定着した2人の保因者と4人の非保因者（補足図2）では、1人は1か月後にD. pigrumが再定着し、2人は3か月後に、そしてすべては6か月後に再定着しました。 M. nonliquefaciens は非保因者 2 名で観察されましたが、6 か月後に再定着した参加者は 1 名のみでした。非保因者に存在する 2 つの主要な分類群である D.pigrum および M.nonliquefaciens が再定着するまでの期間の中央値は 6 か月でした。対照的に、保因者における黄色ブドウ球菌の再定着までの時間の中央値は 3 か月でした。個々の参加者の微生物叢プロファイルを補足図2に示します。

黄色ブドウ球菌キャリアおよび非キャリアにおけるムピロシンのコロニー除去前後の鼻微生物叢の群集構造の進化。各患者（破線）および平均（実線）における平均種比率（A、C）とこれらの比率の非類似度（B、D）の多様性棒グラフを示します。影付きの領域は平均値の 95% 信頼帯です。）。ブレイとカーティスの非類似性の高い値は、脱植民地化前の微生物相の初期状態と比べて群集構造に大きな違いがあることを示します。 8 人の黄色ブドウ球菌キャリア (A、B) および非キャリア (C、 D)。細菌の正式名は、順に、黄色ブドウ球菌、ドロシグラヌルムピグラム、モラクセラノンリケファシエンス、コリネバクテリウムプロピンクム、コリネバクテリウムアコレンス、コリネバクテリウムシュードジフテリチクム、コリネバクテリウムマッギンレイ、表皮ブドウ球菌、クチバクテリウムアクネスです。

微生物群集構造の脱コロニゼーション誘発性変化のより総合的な評価を提供するために、同じ患者の最初の D0 時点と比較して、各時点での種集団の Bray-Curtis 非類似度を計算しました (図 3B、D) ）。平均ブレイ・カーティス非類似性は、保因者と非保因者の両方で脱コロニー化直後に最大となり、微生物叢が最も混乱した状態であることを示しています。驚くべきことに、保因者では相違度が急激に減少したが、非保因者ではほぼ安定したままであった。これは、保因者の微生物相が非保因者よりも早く初期状態に（部分的に）戻ったことを示しており、これは、黄色ブドウ球菌による優勢種と比較してより迅速な再定着と一致している。ノンキャリア。 6 か月後、初期状態との平均相違は保因者と非保因者の両方でかなりの程度 (約 0.5 ～ 0.7) のままでした (図 3B、D)。重要なのは、集団構造の進化は参加者によって大きく異なり（図 3B、D の破線を参照）、微生物叢の回復パターンは急速な回復（1 か月後の相違度 < 0.2）から実質的に回復しない（6 か月後の相違度 > 0.9）まで多岐にわたります。 ) キャリアとノンキャリアの両方。

鼻腔内ムピロシン脱コロニーを受けた黄色ブドウ球菌保因者と非保因者に関するこの縦断的研究では、保因者における黄色ブドウ球菌の再定着が、非保因者における優勢な種による再定着よりも迅速に起こったことを発見した。これらの発見は、黄色ブドウ球菌の定着除去手順の一時的な有効性と、黄色ブドウ球菌の鼻ニッチへの強い適応を強調しています。

コロニー除去に失敗した 1 例の次に、6 か月の追跡期間中に黄色ブドウ球菌の頻繁な再コロニー形成が観察されました。再定着までの時間は 1 ～ 3 か月の範囲であり、ムピロシン治療後再定着までの遅延が 2 週間から 6 か月の範囲であったという以前の観察と一致しています。 571人の参加者のサンプルを2年以上にわたって2ヶ月ごとに収集した別の縦断研究では、抗ブドウ球菌系抗生物質は治療後4ヶ月以内の黄色ブドウ球菌の感染率を増加させ16、抗生物質による微生物叢の破壊が黄色ブドウ球菌の侵入を促進することを示唆している。私たちの研究では、5 件中 4 件の再定着が、最初に保菌者から分離されたものと同じスパタイプで最終的に発生しました。ただし、別の温泉タイプによる一時的なコロニー形成も実証されました。これは、同じ株の縦方向の保菌と、他の株の断続的な保菌を示す他の研究と一致しています16、17、18。長期的な研究では、黄色ブドウ球菌の消失と獲得が自然現象として起こることが示唆されていますが 16,18、再定着のもう 1 つの理由は、定着解除が成功しないことである可能性があります。脱植民地化処理に抵抗すると、再植民地化が促進される可能性があります。しかし、黄色ブドウ球菌の耐性に関するオランダの国家調査では、ムピロシン耐性が低レベル（1%）であることが示されているため、これが研究参加者の再定着を促進する可能性は低いと思われます。咽頭などの未治療の鼻外部位からの再定着、または家族の一員による再定着の可能性がより高い説明です。

黄色ブドウ球菌の喪失に続いて、脱コロニー化により、鼻から表皮ブドウ球菌、ピグラムブドウ球菌および非液化菌が即座に除去された。非保因者では、C. propinquum の存在量が増加する傾向が観察されましたが、効果的に除菌された保菌者では C. acolens および S.epidermidis の増加が示されました。実際、ムピロシン治療は、表皮ブドウ球菌の存在量の減少とともに、（未分類の）コリネバクテリアおよびアクネ菌の相対存在量の増加とこれまで関連付けられてきました20。まとめると、これらの結果は、脱コロニー化治療および黄色ブドウ球菌を含むムピロシン感受性種の除去後の鼻微生物叢の再配置により、新しい分類群が鼻ニッチに侵入できることを意味する。

私たちの研究にはサンプルサイズが小さいこと以外にも限界があります。研究への参加を促進するために、私たちは参加者が定期的な郵便サービスでサンプルを送付できる自己サンプリング戦略を採用しました。この方法は、以前に黄色ブドウ球菌の検出に適していることがわかっています 21,22。それにもかかわらず、輸送の遅れにより、サンプルの 20% がサンプリング後 48 時間以上処理されました。キャリア内の遅延サンプル 27 件のうち培養陰性だったのは 3 件のみであるため、輸送による偽陰性黄色ブドウ球菌培養のリスクは低いと考えられます。ただし、メタバーコーディングのアプローチに対する遅延の影響は不明です。それにもかかわらず、輸送の遅延は、この研究における全体的な再定着の結果には影響を与えませんでした。

脱コロニー化後のサンプル中の黄色ブドウ球菌の存在に関して、定量的培養結果と RNA メタバーコーディングの間に不一致が見つかりました。我々は、黄色ブドウ球菌保菌の定義と一致して、脱コロナイゼーション後の黄色ブドウ球菌陽性培養（> 8 CFU/mL）に基づいて再定着を定義しました。鼻腔内の細菌量の変化、内在微生物叢の組成、さらには複数ステップの RNA メタバーコーディング解析に追加される配列決定施設への輸送の潜在的な影響は、培養結果とのこのような差異を説明する多くの要因の 1 つです。どちらの方法でも、再植民地化ステータスについては 3 つの航空会社のみで一致しました。

全体として、我々の発見は、ムピロシン治療に対する鼻腔細菌群集の感受性を強調し、脱コロニー化標的、すなわち黄色ブドウ球菌が非キャリアの優勢種よりも比較的早く鼻ニッチに再侵入するという事実を強調している。これは、循環している黄色ブドウ球菌分離株を排除する手段ではなく、特定されたリスクのある介入に先立つ短期予防処置としてのムピロシンの現在の使用を裏付けるものである。

これは、オランダにおける健康な黄色ブドウ球菌キャリアと非キャリアを対象とした前向き介入コホート研究です。すべての実験は、オランダの被験者を対象とした医学研究法 (WMO) に従って実施されました。この研究プロトコールは、オランダのロッテルダムにあるエラスムス大学医療センターの地元の医療倫理委員会によって承認されました（MEC-2018-091）。すべての参加者について書面によるインフォームドコンセントが得られました。参加者はオランダの大学の広告や研究チームのソーシャルネットワークを通じて募集された。除外基準は、年齢が18歳未満、募集の3か月前に抗生物質、抗寄生虫薬、抗真菌薬またはプロバイオティクスを使用していること、介入治療の成分に対する既知のアレルギー、妊娠中および授乳中の女性、免疫系に影響を及ぼす既知の慢性疾患、重度の慢性皮膚疾患、免疫不全状態、または免疫抑制剤の使用。

適格性アンケートに記入した後、すべてのボランティアは、前述のように黄色ブドウ球菌保菌のスクリーニングを受けました23。黄色ブドウ球菌の保菌は、毎週 2 回の鼻腔スワブの定量培養によって測定されました。持続性黄色ブドウ球菌キャリアは、各培養物で > 8 CFU/mL の 2 つの陽性培養物として定義されました。非キャリアは、2 つの黄色ブドウ球菌陰性培養物として定義されました。間欠性黄色ブドウ球菌キャリアは、今後の研究への参加から除外された。資格のあるボランティアは先着順で登録されました。

適格な参加者は、黄色ブドウ球菌感染の危険因子に関するアンケートに記入するよう求められました。すべての参加者は脱植民地化治療を受けました。コロニー除去は、ムピロシン鼻軟膏（2%、GlaxoSmithKline BV、Zeist、オランダ）を1日2回、およびグルコン酸クロルヘキシジン皮膚溶液（4%w/v、Regent Medical Abroad Limited、英国オルダム、英国）を1日1回、両方5日間行うことから成りました。

鼻サンプルは、除菌の 1 日前 (D0)、除菌後 2 日 (D7)、1 ヶ月 (M1)、3 ヶ月 (M3)、および 6 ヶ月 (M6) に採取されました。参加者全員は、主任研究員による鼻採取の個人的なデモンストレーションを受けました。その後、参加者は、一方の鼻孔に綿棒 (ESwab、490CE.A、コパンイタリア、イタリア、ブレシア) を挿入して 5 回回転させ、同じ綿棒を使用して 2 番目の鼻孔でもこれを繰り返すことにより、すべての標本を採取しました。スワブは、収集および輸送ソリューションである 1 ml の Modified Liquid Amies を満たした容器に収集され、通常の郵便サービス (温度管理されていない) で送られるか、研究室に個人的に預けられました。

黄色ブドウ球菌の定量的培養を実施して、コロニー除去後の6ヶ月の追跡期間にわたる黄色ブドウ球菌の保菌力学を調べた。スワブ容器をプレーティングする前に 20 秒間ボルテックスしました。アミーズ培地の段階希釈物をフェノールマンニトール塩寒天 (PHMA) 上にプレーティングし、37 °C で 2 日間インキュベートしました。スワブをフェノールマンニトール塩ブロス (PHMB) に入れ、濃縮するために 37 °C で 7 日間インキュベートしました。黄色ブドウ球菌の増殖は、ラテックス凝集試験（Staph Plus Latex Kit、Diamonial、ウィーン、オーストリア）によって確認されました。形態学的に異なる黄色ブドウ球菌コロニーを、BBL CHROMagar MRSA II 寒天培地 (BD、ブレダ、オランダ) を使用してスパタイピングおよびメチシリン耐性スクリーニングのために選択しました。

黄色ブドウ球菌分離株の分子タイピングを実施して、脱コロニー化されたキャリアにおける黄色ブドウ球菌の再定着に同じスパ型が関与するかどうかを推論した。タイピングは、黄色ブドウ球菌陽性培養の最後の瞬間と、再定着したキャリアでの脱コロニー後の黄色ブドウ球菌陽性の最後の培養瞬間に限定されました。黄色ブドウ球菌 DNA ライセートは、10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA 二ナトリウム、pH 8.0 で煮沸するか、製造元の指示に従って QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN、オランダ、フェンロー) で抽出することによって調製しました。黄色ブドウ球菌プロテイン A (spa) リピート領域の増幅は、2 セットのプライマーを使用した PCR によって実行されました。 1 つのセットは、フォワードプライマー spa-1113、5'-TAAAGACGATCCTTCGGTGAGC-3' およびリバースプライマー spa-1514、5'-CAGCAGTAGTGCCGTTTGCTT-3'24 から構成されました。他のセットは、フォワードプライマー spa-F1、5'-AACAACGTAACGGCTTCATCC-3' および spa-F2 5'-AGACGATCCTTCAGTGAGC-3'、およびリバースプライマー spa-R1 5'-GCTTTTGCAATGTCATTTACTG-3' から構成されていました。メーカーの指示に従って、アンプリコンをExoSAP-IT (Applied Biosystems)で精製し、配列分析のために送った(Baseclear, Leiden, The Netherlands)。結果として得られた配列は、BioNumerics v7.6 (Applied Maths NV、シント・マルテンス・ラーテム、ベルギー) を使用して分析され、スパのタイプは RidomStaphType データベース (Ridom GmbH、ヴュルツブルク、ドイツ) を使用して割り当てられました。

鼻のマイクロバイオームに対するデコロニー化の影響と、デコロニー化後のマイクロバイオーム構造の回復を、16S rRNA メタバーコーディングによって調べました。各鼻腔スワブ容器からのアミーズ培地は、受け取った当日にニュージャージー州ロッテルダムの研究研究所で - 80 °C で保管され、その後、-80 °C でフロリダ州リヨンのマイクロバイオーム分析研究所に送られました。生きた微生物叢に対する脱コロニー化の影響を適切に捉えるために、メタバーコーディングでは、DNA は長期間存続する可能性があるため、DNA コード配列ではなく、RNA ベースの 16S リボソーム RNA (rRNA、生細胞中に保存されるが、細胞死または溶解後にすぐに除去される) を使用しました。細胞死後の長期間 25、26、27、28。 Mag Bind® Total RNA 96 Kit (Omega Bio-tek) 組織プロトコルを使用して、150 μL のサンプル材料から RNA を抽出しました。ビーズ (Disruptor plate C plus - Omega Bio-tek) とプロテイナーゼ K を使用して細胞溶解を 2600 rpm で 15 分間行い、続いて撹拌せずに室温で 10 分間行い、室温で 20 分間の DNase I 消化で終了しました。。 Tecan Safire (TECAN) の QuantiFluor RNA キットを使用して RNA を定量しました。 10 ng の全 RNA を、FIREScript RT cDNA 合成キット (Solis Biodyne) とランダムプライマーを使用した逆転写に使用し、その後 cDNA を SPRIselect 試薬 (Beckman coulter) で精製し、定量しました。

rRNA V1 ～ V3 領域は、5× HOT BIOAmp® BlendMaster Mix 12.5 mM MgCl 2 (Biofidal)、10× GC リッチエンハンサー (Biofidal)、および BSA 20 mg/mL を使用して PCR 増幅しました。 PCR 反応は、25 μL の溶液中でフォワードプライマー 27F、5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' およびリバースプライマー 534R、5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGATTACCGCGGCTGCTGG-3' を使用した 56 °C での 30 サイクルで構成されました。 PCR産物は、20μLのヌクレアーゼフリー水中でSPRIselectビーズ（Beckman Coulter）を使用して精製し、QuantiFluor dsDNA（Promega）を使用して定量しました。サンプルは、12サイクルのPCR中に同じPCR試薬を使用してイルミナのバーコードでインデックス付けされ、その後、前述のように精製および定量されました。サンプルを正規化してプールし、2 × 300 bp ペアエンドアプリケーションに関するコンストラクターの推奨に従って、Illumina MiSeq V3 フローセルを使用して配列決定しました。サンプルあたり平均 130,000 回の校正読み取りが得られました。

実験バッファーは、サンプル外の細菌 RNA による汚染を検出するためのネガティブコントロールとして使用されました。 RNA 抽出は、同じ割合で生きた黄色ブドウ球菌 ATCC29213 と大腸菌 ATCC25922 を社内で混合したものを使用して制御され、グラム陽性菌と陰性菌の抽出バイアスを評価することができました。 PCR 増幅バイアスは、8 種類の細菌種の市販 DNA ミックス (ZymoBIOMICS™ Microbial Community DNA Standard) を使用して制御されました。

シーケンスリードの品質をチェックし、トリミングしました。ペアエンドリードペアは、BBMap バージョン 38.49 (https://sourceforge.net/projects/bbmap/ で入手可能) を使用してマージされ、最小シングルサイズ 150 bp 以外のデフォルトオプションと平均 Phred 品質スコアが 10 を超えました。ペアの合計サイズは最小 400 bp。 PCR アダプターは、cutadapt v.2.1 (Martin 2011) で削除され、その後、sizeout オプションを指定した vsearch v.2.12.029 を使用して複製解除されました。種の割り当てでは、最大 20 の参照ターゲットを維持しながら、Blastn v.2.11.0+30,31 を使用してリードを NCBI blast 16S_ribosomal_RNA データベース (バージョン日 03.12.2020) の配列にアライメントしました。細菌種ごとの読み取り数は、分類群内の平均遺伝子コピー数に基づいた NCBI rrnDB-5.5 データベースを使用して、16S rRNA 遺伝子のコピー数の分類群固有の変動を考慮して正規化されました。

シーケンシングリードの分類学的割り当ての解像度を最適化するために、https://github.com/rasigadelab/taxonresolve で公開されている社内のバイオインフォマティクスソフトウェアを使用しました。簡単に言うと、リードが同一のアライメントスコアを持つ複数の種の配列と一致する場合、分類学的割り当てパイプラインは通常、属などのより高い分類レベルを出力します（たとえば、リードが黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌に一致する場合、ブドウ球菌属）。種レベルの識別が重要な場合、この情報の損失は問題となる可能性があります。種レベルの情報の損失を防ぐために、taxonresolve ソフトウェアは、種が不確かなリードを属ではなく種のグループに割り当てます。

キット試薬などの汚染源から存在すると考えられ、ネガティブコントロールに含まれる細菌種（主にバチルス属）は除去されました。合計 1,376 種または種のグループが保存されました。サンプル内の種の豊富さを評価するためのシーケンスの取り組みに対応する希薄化曲線を補足図3に示します。ほとんどのサンプルは、40,000シーケンス後にプラトーに達しました。

この研究で考慮された変数と種の数に比べてサンプルサイズが小さいことを考慮して、仮説検定は実行されず、結果の記述的な評価を提供します。図では、平均値の 95% 信頼区間は、CFU/mL の対数変換および比率など [0, 1] 区間に限定された量の対数オッズ変換後、正規近似に基づいて計算されました。

微生物の多様性分析では、最も蔓延している 9 種の細菌種を保持し、他の種を「その他」カテゴリーにまとめました。微生物叢の破壊と回復の可能性を評価するために、最初の治療前の微生物叢 (D0) と比較したサンプルの微生物叢の相違を、同じ患者の最初のサンプルと比較した各サンプリング時点での Bray-Curtis 相違度を使用して評価しました。。

分析のソフトウェアコードは、https://github.com/rasigadelab/macotra-metabarcoding で入手できます。データは https://zenodo.org/record/6382657 で入手できます。分析と図には、https://www.microbiomeanalyst.ca36,37 で入手可能なパッケージ dplyr33、ggplot234、vegan35、および MicrobiomAnalyst を含む R ソフトウェア v3.6.032 を使用しました。

この研究のために生成されたデータセットは、Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.6382657) で公開されています。

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この研究への貢献に参加者の皆様に感謝いたします。研究室での支援については Willem van Wamel、Patricia Vellekoop、Willemien Zandijk に感謝します。また、この論文で使用したメタバーコーディング戦略に関する洞察力に富んだ議論と支援を提供してくれた Agnès Nguyen (Biofidal、ヴォーアンヴラン、フランス) に特別な謝意を表します。この研究は、ZonMw 助成金番号 547001006 および ANR 助成金番号 16-JPEC-0006 によって資金提供された MACOTRA プロジェクトの一部でした。補足情報に記載されている MACOTRA 研究グループのメンバー全員に感謝します。

これらの著者は同様に貢献しました: Valérie O. Baede、Anaïs Barray、Margreet C. Vos、Jean-Philippe Rasigade。

エラスムス MC 大学医療センターロッテルダム、医療微生物学および感染症学部、ロッテルダム、オランダ

ヴァレリー・O・ベイデ、メーリ・タヴァコル、マーグリート・C・ヴォス

CIRI、国際感染症研究センター、リヨン大学、Inserm U1111、リヨン高等師範学校、リヨン第一大学、CNRS、UMR5308、リヨン、フランス

アナイス・バレイ、ジェラール・リナ、ジャン＝フィリップ・ラシガード

国立ブドウ球菌参照センター、感染症研究所、クロワ・ルース病院、リヨン・ホスピス、リヨン、フランス

アナイス・バレイ、ジェラール・リナ、ジャン＝フィリップ・ラシガード

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AB と VB がオリジナルの原稿を書きました。 MV と JPR は原稿をレビューおよび編集しました。MV、GL、JPR はプロジェクトの概念化と監督を行いました。VB と MT はコホートの募集を実施しました。 AB、VB、および MT は、in vitro 方法論を設計し、データと図を作成しました。AB は、この研究のためのバイオインフォマティクスおよび生物統計解析プログラムを開発しました。 AB、VB、MT、JPR は統計分析を実施しました。著者全員が原稿をレビューしました。

ジャン＝フィリップ・ラシガードへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Baede, VO、Barray, A.、Tavakol, M. 他黄色ブドウ球菌キャリアおよび非キャリアにおけるムピロシン治療後の鼻のマイクロバイオームの破壊と回復。 Sci Rep 12、19738 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-21453-4

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受信日: 2022 年 5 月 7 日

受理日: 2022 年 9 月 27 日

公開日: 2022 年 11 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21453-4

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