真菌細胞の障壁と細胞小器官はポリヘキサメチレンビグアニド (PHMB) によって破壊されます

Scientific Reports volume 13、記事番号: 2790 (2023) この記事を引用

691 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

真菌細胞と哺乳動物細胞の類似性は、抗真菌剤による宿主薬物標的の薬物交差認識により、真菌感染症の治療法の開発に固有の課題を引き起こします。したがって、治療に利用できる薬物クラスの数は限られています。治療は抗真菌耐性の獲得と蔓延によってさらに制限されており、これが新しい治療法の緊急の必要性の一因となっています。ポリヘキサメチレンビグアニド (PHMB) は、殺菌、殺寄生虫、および殺真菌作用を持つカチオン性抗菌ポリマーです。抗真菌薬の作用機序には、微生物細胞構造の優先的な機械的破壊が含まれるようで、従来の抗真菌薬に代わるものとなります。しかし、抗真菌のメカニズムはほとんど研究されていません。この研究の目的は、選択された酵母 (Saccharomyces cerevisiae、Candida albicans) および糸状菌種 (Fusarium oxysporum、Penicillium glabrum) に対する PHMB の活性を特徴付けることでした。 PHMB の真菌膜破壊、細胞侵入および細胞内局在化活性を、生存プローブ侵入およびポリマー局在化研究を使用して評価しました。我々は、PHMB が最初に真菌細胞膜を透過化し、その後サイトゾル内に蓄積することを観察しました。サイトゾルに入ると核膜を破壊し、DNA の結合と断片化を引き起こします。 PHMB と膜との静電相互作用は、他の細胞内小器官がその作用の潜在的な標的である可能性があることを示唆しています。全体として、結果は複数の抗真菌メカニズムを示しており、これはその広範囲の有効性を説明するのに役立つ可能性があります。 PHMB の作用機序をより深く理解することは、改良された抗真菌治療戦略の開発に役立つ可能性があります。

侵襲性真菌感染症の割合が増加しているにもかかわらず、臨床で使用されている抗真菌薬の化学クラスは、アゾール、エキノカンジン、ポリエン、ピリミジン類似体、アリルアミンの 5 つだけです1。これらの薬剤には多くの制限があり、特定の新興真菌感染症に対処するには不十分です。その後、治療結果は依然として好ましくないため、それらは臨床上のニーズを満たしていません2。関連する制限には、バイオアベイラビリティーの低下、真菌病原体と宿主間の生化学的重複、耐性の出現などが含まれます3,4。各クラスは主に単一の細胞標的を阻害し、静真菌または殺真菌の結果をもたらすため、耐性の増加の一部は、これらのクラスの抗真菌機構によって引き起こされます2。さらに、フルコナゾールに対する C. glabrata や C. krusei 耐性など、一部の真菌種は一部の抗真菌薬に対する固有の感受性の低下を示します4。もう 1 つの制限は、これらの薬剤の投与経路によるアクセスのしやすさです。たとえば、エキノカンジンクラスは、高分子量などの化学的特性により、経口バイオアベイラビリティが不十分です。これを回避するために、毎日静脈内投与されますが、これは多くの状況において長期治療の選択肢としては現実的ではありません5。したがって、これらの既存のクラスの抗真菌剤は、特により重篤な浸潤性感染症を考慮した場合、真菌感染症の満たされていない臨床ニーズを満たしていません。

活性基と微生物表面との静電相互作用を通じて広範囲の微生物を殺す能力があるため、さまざまなカチオン性抗菌ポリマーが現在開発中、またはすでに臨床で使用されています6。活性カチオン基の例には、アンモニウム基、ハラミン、ビグアニド、またはポリリジンが含まれます7。これらのポリマーを長期間使用したにもかかわらず、真菌ではこれらの薬剤に対する獲得された抗菌耐性は観察されていません。これは、細胞障壁に対する非特異的メカニズムに起因すると考えられます。したがって、抗菌ポリマーの使用は、強力な抗真菌解決策を見つける競争において潜在的に優れた戦略を提供する可能性がある。しかし、そのような一般的な細胞破壊特性は、宿主細胞に対する一般的な細胞毒性効果に関する毒性学的懸念も引き起こします。異なるカチオン性基は、微生物および宿主細胞に対して異なる効果をもたらすようです。例えば、グアニジンポリマーは、アミンポリマーと比較して、表皮ブドウ球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、大腸菌、およびカンジダアルビカンスに対してより強力である一方で、ヒト角化細胞に対する毒性が低いことが示されています7。

ポリヘキサメチレンビグアナイド (PHMB) は、ビグアナイド単位の繰り返しからなる合成カチオン性ポリマーで、細菌や真菌に対する効果的な抗菌剤として確立されています9,10。ビグアニド基により広範囲の抗菌活性を備えた高い治療指数を示しますが、抗菌耐性獲得の報告はありません 7,11。細菌種に対する PHMB の抗菌活性について現在受け入れられているモデルは微生物膜透過性によるもので、PHMB はリン脂質との相互作用を通じて微生物細胞膜に細孔を形成することで微生物細胞を選択的に殺します 12、13、14。微生物細胞と比較して、PHMB は哺乳動物の細胞膜上の細胞膜糖タンパク質に対して比較的低い活性を示し、これがポリマーの高い治療指数を説明しています 14,15。しかし、膜破壊モデルでは、PHMB16 への曝露後の大腸菌における DNA 修復経路の誘導を説明できません。提案されている代替作用機序には、細胞内標的を阻害するために、微生物細胞へのPHMBのエネルギー媒介細胞侵入が含まれる可能性がある。このメカニズムは Bacillus megaterium で観察され、PHMB は細胞質内に局在しており、検出可能な細胞膜損傷はありません 17。

真菌の場合、PHMB の作用機序に関する知識は限られていますが、細胞壁の不安定化を伴う同様の機序が提案されています 18,19。 S. cerevisiae 細胞壁の β-グルカン構造は、PHMB 破壊の標的であると報告されており、遺伝子発現研究では、細胞維持のための細胞壁完全性遺伝子 (CWI) およびプロテインキナーゼ C (PKC) の発現の増加が示されています。厳しい環境条件18,19。

この研究では、選択された真菌種であるサッカロマイセス・セレビシエ（S288c; ATCC）、フザリウム・オキシスポラム、ペニシリウム・グラブラムおよびカンジダ・アルビカンスR1に対するPHMBの抗真菌作用機序を調査する。これらは一般的な病原性酵母および糸状菌の代表であるからである。我々は、細菌や哺乳類の細胞で以前に観察されたように、PHMB が最初に真菌の細胞膜を透過化し、その後サイトゾル内に蓄積することを実証します 17。 PHMB は、哺乳動物細胞で見られるように、エンドソーム内に捕捉されたままではありません。代わりに、それは漏れ出て真菌の核膜を破壊します。真菌の染色体の凝縮と細胞死を引き起こします。核膜に加えて、PHMB は他の細胞小器官の膜を破壊する可能性があります。対照的に、PHMB は哺乳動物細胞のエンドソーム内に捕捉されたままであり、このポリマーが微生物と非微生物の真核細胞構造を区別していることを示唆しています。全体として、この結果は、PHMB の抗真菌機構と真核微生物に対するその選択毒性を説明するのに役立ちます。

真菌株は、Saccharomyces cerevisiae (S288c; ATCC)、Fusarium oxysporum、Penicillium glabrum、およびCandida albicans R1 (S. Kelly; University of Sheffield)でした。まず、サブローデキストロース寒天培地 (SDA) を使用してプレート上で菌類を 30 °C で 48 時間増殖させました。一晩培養するために、単一の酵母コロニーを液体培養物(2%グルコースを補充したRPMI-1640培地(Sigma))に移した。糸状菌は、胞子収集のために 2% グルコースを補充した RPMI-1640 培地 3 ml ですすぎ、30 °C で一晩増殖させました。

PHMB およびローダミンで標識された PHMB (PHMB-ローダミン) は英国の Tecrea Ltd から入手し、ストック溶液は滅菌 dH2O で作成されました。テルビナフィン (Sigma-Aldrich) ストック溶液は 80% エタノールで作成されました。膜透過化アッセイに適した濃度範囲を決定するために、PHMB、ネガティブコントロール (テルビナフィン) およびポジティブコントロール (Triton x-114) の最小阻止濃度を、ブロスを使用して RPMI-1640、2% グルコース中のすべての真菌種に対して決定しました。微量希釈法20,21。薬剤の段階希釈を含む 96 ウェルマイクロプレートに、真菌 (S. cerevisiae、F. oxysporum、P. glabrum、および C. albicans R1) を 1 × 104 細胞/ml で接種しました。プレートを30℃で48時間インキュベートし、OD600nmで吸光度を測定しました。～９０％の真菌増殖を阻害するＰＨＭＢの最低濃度をＭＩＣ９０として決定し、～５０％の増殖をＭＩＣ５０としてそれぞれ決定した。

PHMB、テルビナフィン、および Triton x-114 100 μl を、真菌 (S. cerevisiae、F. oxysporum、P. glabrum、および C. albicans R1) を含む 96 マイクロウェルプレートのウェルに、最終濃度 1 × 104 細胞/ml で添加しました。 MIC50濃度。菌類は完全に溶解した後、最大相対蛍光単位 (RFU) の陽性対照として加熱死滅させました。真菌培養物をガラス試験管に移し、ブンゼンバーナーの炎で 10 秒間加熱して死滅させました。 Triton x-114 (Sigma Aldrich) を、完全な膜透過性のための最大 RFU のポジティブコントロールとして使用しました。膜透過活性をもたない抗真菌薬であるテルビナフィンを、膜透過をもたない細胞死のネガティブコントロールとして使用しました。膜透過性 DNA 結合剤である SYTOX Green (Molecular Probes) を最終濃度 8 μM になるまで各ウェルに添加しました。蛍光強度は、Tecan M200 Infinite Pro Microplate Reader と Magellan ソフトウェアバージョン 7.0 を使用して、485 nm 励起 / 520 nm 発光で 15 分ごとに 3 時間、30 °C で測定しました。

PHMB の段階希釈を最高濃度 32.4 μg/ml で行い、96 ウェルマイクロプレート内の真菌細胞 (S. cerevisiae、F. oxysporum、P. glabrum、および C. albicans R1) に 1 × 104 細胞/ml で添加しました。。 8 μM SYTOX Green (Thermofisher) もプレートに添加し、3 時間インキュベートしました。 3時間後に蛍光測定を行った。

PHMB の段階希釈を最高濃度 4.05 μg/ml で行い、S. cerevisiae 培養物 (1 × 104 細胞/ml) に添加し、8 μM SYTOX Green (Thermofisher) とともに 30 °C で 3 時間インキュベートしました。サンプルを12,000 rpmで5分間遠心分離しました。上清を捨て、細胞ペレットをPBSで洗浄した。細胞は、Axiovision Relを備えたLeica DMIRB倒立顕微鏡を使用して画像化されました。 4.8 ソフトウェア (Zeiss) およびグリーンバンドパスフィルターと位相コントラストを使用する 40 × 対物レンズ。

ローダミンで標識されたＰＨＭＢは、英国のＴｅｃｒｅａＬｔｄから入手した（ＰＨＭＢ－ローダミン）。標識後の PHMB の抗真菌機能が失われていないことを確認するために、S. cerevisiae の芝生培養物を SD 寒天上で調製し、1 mg/ml PHMB (Tecrea Ltd.) および 1 mg/ml PHMB-ローダミン 30 のスポット 10 μl とともにインキュベートしました。 ℃で48時間。

S.セレビシエ培養物を4μg/mlおよび8μg/mlのPHMB-ローダミンで処理した。 C.アルビカンスのアリコートを8μg/mlおよび12μg/mlで処理した。インキュベーションステップ中、サンプルは光から保護されました。未処理の対照をRPMI 1640、2%グルコースで処理しました。サンプルを室温で 4 時間インキュベートし、12,000 rpm で 5 分間遠心分離しました。得られた上清を廃棄し、細胞ペレットをＰＢＳ中５０μｌの４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定した。サンプルを PBS で再懸濁し、12,000 rpm で 5 分間遠心分離しました。上清を廃棄し、細胞ペレットをPBSに再懸濁した後、Alexa Fluor 488（Thermofisher）と結合した50μg/mlのConcanavalin AおよびDAPIを含む10μl Prolong Diamond Antifade Mountant（Thermofisher）で対比染色した。すべてのサンプルは、カバースリップを備えた顕微鏡スライド上にマウントされ、マニキュア液で密封されました。スライドは光から保護して 4 °C で保管しました。共焦点画像は、Leica SP5 共焦点顕微鏡で撮影されました。 S. cerevisiae および C. albicans の連続 Z スタック (スライス番号それぞれ 59 および 35) は、64 の線平均 (256 × 256、ズーム係数 8) を使用して収集されました。超解像度放射状変動 (SRRF) 解析は、線平均 1 で 1000 フレーム (256 × 256、ズーム係数 8) を取得して実行され、ImageJ バージョン 1.52i を使用して処理されました。

S.セレビシエを4μg/mlおよび8μg/mlのPHMB-ローダミンで処理し、C.アルビカンスを8μg/mlおよび12μg/mlで処理した。すべてのサンプルは、光から保護され、30 °C で 4 時間インキュベートされました。未処理の対照を同量のRPMI-1640、2%グルコースで処理した。蛍光顕微鏡について前述したように、サンプルを固定し、対比染色しました。サンプリングされた細胞 (n = 20) の Con A-Alexa Fluor 488 膜蛍光強度を、細胞膜に沿った 4 つの対称点で測定しました。データポイント = (平均 ± SD)。

蛍光強度データは、反復測定 (RM) 一元配置または二元配置分散分析 (ANOVA) に続いて、GraphPad Prism 7 ソフトウェアを使用した Tukey の多重比較検定によって分析されました。有意性 = p < 0.05。

膜透過化アッセイに適した濃度範囲を決定するために、S. cerevisiae、C. albicans、F. oxysporum、および P.酵母および糸状菌の代表的な種としてのglabrum。 PHMB-ローダミン MIC90 も測定し、未標識の PHMB と比較して、標識後の抗真菌活性の損失がないことを確認しました。酵母細胞は、増殖阻害に必要なPHMB濃度が低いため、糸状菌よりもPHMB攻撃を受けやすいようです（表1）。この研究では、C. albicans R1 および S. cerevisiae に対するテルビナフィンの MIC は、報告されている値よりわずかに低くなります 22,23。しかし、F. oxysporum および P. glabrum で観察された MIC は、試験した真菌種について報告された範囲と一致しています 24,25。

真菌細胞膜の PHMB 透過化のレベルを評価するために、4 種 (S. cerevisiae、F. oxysporum、P. glabrum、および C. albicans R1) を使用して生存率染色アッセイを使用しました。生存率プローブ SYTOX Green は、無傷の膜を持つ健康な細胞からは排除されますが、細胞膜損傷後に細胞に侵入する可能性があります。細胞侵入時に、SYTOX Green は DNA に結合し、ベースライン蛍光を上回る緑色蛍光収量の増加をもたらします。抗真菌テルビナフィンをネガティブコントロールとして使用し、膜破壊がない場合の抗真菌効果を実証しました。陽性対照として、細胞を加熱死滅させるか、Triton X-114 処理しました。培養のみのネガティブコントロールは、SYTOX Green のベースライン蛍光を示しました。すべての真菌種について、培養のみの対照は、経時的に約 4000 ～ 5000 の相対蛍光単位 (RFU) で一定のままでした (図 1)。各真菌種におけるテルビナフィン陰性対照では、ベースライン蛍光を超える蛍光のわずかな増加のみが観察されました。熱で死滅させたポジティブコントロールは、各種について時間 0 で蛍光の大幅な増加を示し、時間の経過とともに比較的一定のままでした。 Triton X-114 陽性蛍光コントロールも、時間 0 で S. cerevisiae および C. albicans の蛍光の大幅な増加を示しました。ただし、F. oxysporum および P. glabrum については、Triton X-114 陽性対照はわずかな蛍光の増加のみを示しました。蛍光の増加。

PHMB 関連の膜透過性に対する時間の影響。真菌は PHMB [MIC50] および SYTOX Green (8 μM) で処理されました。 PHMB で処理した各種の蛍光プロファイルを、陽性対照 (熱殺菌; トリトン X-114) および陰性対照 (テルビナフィン; 未処理) とともに示します。 (A) 加熱殺菌または 1 μg/ml PHMB、0.84 μg/ml テルビナフィン、1.17 μg/ml トリトン x-114 で処理した S. cerevisiae (B) 加熱殺菌または 1 μg/ml PHMB で処理した C. albicans R1 、0.84 μg/ml テルビナフィン、1.17 μg/ml トリトン x-114 (C) 加熱殺菌または 2 μg/ml PHMB、3.84 μg/ml テルビナフィン、4.7 μg/ml トリトン x-114 で処理した F. oxysporum (D) P. グラブラムを加熱死滅させるか、2 μg/ml PHMB、1.7 μg/ml テルビナフィン、2.5 μg/ml トリトン x-114 で処理しました。

同様に、PHMB MIC50 で処理した S. cerevisiae および C. albicans は 15 分で蛍光の大幅な増加を示し、膜透過性を示しました。しかし、糸状菌では、PHMB 処理後に F. oxysporum は蛍光のわずかな増加を示したが、P. glabrum は蛍光の増加を示さず、細胞透過性が最小限またはまったくないことを示唆しています。

PHMB 膜の透過性とその後の SYTOX 緑色蛍光を視覚化するために、S. cerevisiae 生細胞を PHMB で 3 時間処理し、蛍光顕微鏡イメージングを使用して検査しました。未処理の細胞は検出可能な蛍光を示さなかった。対照の熱死滅陽性サンプルは、ほとんどの細胞で強い細胞関連 SYTOX 緑色蛍光を示しました。細胞膜透過性/SYTOX 緑色蛍光は、PHMB の濃度が上昇するにつれて (0.51 ～ 2.03 μg/ml)、MIC 値と密接に一致して増加しました (図 2)。 PHMB 濃度が MIC90 を超えると、蛍光を示す細胞の割合と蛍光の強度が減少しました。これは、PHMB が細胞内の DNA と相互作用し、その後の SYTOX グリーンによる結合をブロックしていることを示唆しています。

SYTOX Green に対する膜透過性に対する PHMB の効果を示す蛍光イメージング。 SYTOX Green (8 μM) およびさまざまな濃度の PHMB を増殖培地に添加し、その後 S. cerevisiae と 3 時間インキュベートしました。生細胞画像は、位相差および緑色バンドパスフィルターによるイメージング後に統合されました。スケールバー = 10 μm。

真菌細胞膜の完全性に対する PHMB 曝露の影響を調べるために、S. cerevisiae および C. albicans をそれぞれの MIC90 濃度以上の PHMB-ローダミンで処理し、Con A-Alexa Fluor 488 で対比染色しました。S. cerevisiae (MIC90 = 4μg/ml、MIC90 = 8μg/ml以上）およびC. albicans（MIC90 = 8μg/ml、MIC90 = 12μg/ml以上）。 ImageJ を使用して、ランダムに選択した細胞 (n = 20) の細胞膜に沿った 4 つの対称点を測定することにより、膜蛍光を定量化しました (図 3)。膜染色された Con A-Alexa Fluor 488 の蛍光強度は、両方の種において PHMB 濃度の増加とともに減少しました。

増加する濃度のPHMBへの曝露後のCon A膜蛍光の減少を示す蛍光イメージング。 (A) S. cerevisiae 培養物を 4 μg/ml および 8 μg/ml の PHMB-ローダミンで処理しました (B) C. albicans 培養物を 8 μg/ml および 12 μg/ml で処理しました。培養物を室温で 4 時間インキュベートし、Con A-Alexa Fluor 488 で対比染色しました。未処理のコントロール = 増殖培地のみ。画像は、PHMB 濃度の増加に伴う膜蛍光強度の消光を示しています。グラフは、細胞膜に沿った 4 つの対称点でサンプリングされた細胞 (n = 20) の蛍光強度の測定値を示し、平均値 (平均 ± SD) を示します。膜蛍光は、RM 一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定によって分析されました。

細胞膜透過性の程度に対するPHMB濃度の影響を決定するために、最大32μg/mlまでのPHMB濃度の範囲を3時間後の蛍光値に対してプロットしました(図4)。蛍光は、すべての真菌種についてサブMIC50のバックグラウンドに留まりました。ただし、S. cerevisiae では 0.25 μg/ml、C. albicans では 0.38 μg/ml、F. oxysporum では 1.01 μg/ml で濃度依存的に蛍光が増加し、最大蛍光ピークは PHMB MIC50 濃度またはその付近で発生しました。細胞膜透過性の増加により、S. cerevisiae (12,143 RFU、1.01 μg/ml)、C. albicans (7091 RFU、1.01 μg/ml)、および F. oxysporum (2,503 RFU、3 μg/ml) について。 PHMB 濃度が MIC90 を超えると、SYTOX 緑色蛍光が失われます。 PHMB は DNA16 に結合する能力があるため、SYTOX グリーン結合と競合して蛍光シグナルを消光すると考えられます。 PHMB の透過化は濃度と時間の両方に依存するようであるため、収集したデータから PHMB の取り込み速度を計算しました。細胞膜透過性/SYTOX緑色蛍光の増加が以前に観察されなかったため、P. glabrumは除外されました。

真菌の細胞膜透過性に対する PHMB 濃度の影響。 SYTOX Green (8 μM) および PHMB 濃度を RPMI-1640、2% グルコース中の真菌 (1 × 104 細胞/ml) に添加しました。サンプルを 3 時間インキュベートし、インキュベーション期間後に蛍光測定を行いました。 (A) P. グラブラム (B) F. oxysporum (C) C. albicans (D) S. cerevisiae。黄色の矢印 = MIC50 濃度。青い矢印 = MIC90 濃度。

真菌への PHMB の取り込み速度を決定するために、PHMB 濃度を細胞膜の最大透過化にかかるそれぞれの時間に対してプロットしました。ここで、最大細胞膜透過性は、SYTOX Green: DNA 結合によって生成される最大蛍光 (RFU) です (図 5)。 30℃での取り込み速度は、F. oxysporum、S. cerevisiae、C. albicans についてそれぞれ 0.03775 μg/ml min-1、0.03177 μg/ml min-1、0.04607 μg/ml min-1 と計算されました（表 2）。 PHMB 濃度が 8 μg/ml 以上の場合、真菌の細胞膜透過性は即座に現れ、すべての種について時間 0 で最大 RFU 値が達成されます。 F. oxysporum の場合、最大透過性は MIC90 濃度で約 180 分、MIC50 濃度では 180 < 分で到達します。

F. oxysporum、S. cerevisiae、および C. albicans による PHMB 取り込み率。取り込みは、8μg/ml以上の濃度でそれぞれ0.04μg/ml min-1、0.03μg/ml min-1、0.05μg/ml min-1と計算された。 (A) F. oxysporum、(B) C. albicans、(C) S. cerevisiae。赤線 = MIC90 濃度、黄線 = MIC50 濃度、青線 = 線形回帰。

細胞内局在を確認するために、固定酵母細胞に対して共焦点画像解析を実施した。 Zスタックイメージングによって撮影された酵母細胞の断面図では、S. cerevisiaeとC. albicansの両方におけるPHMBの細胞内蓄積が確認されます（図6、7）。プロット分析では、両方の種の細胞質と比較して、細胞膜上に PHMB が低濃度で存在することも示しています。 C. albicans および S. cerevisiae における PHMB の核局在は、大部分の細胞で明らかでした。さらに、DAPI 染色は他の細胞染色と比較して弱かったが、これはすべての核が無傷ではないため、核破壊によるものと考えられる。したがって、PHMB は細胞に入り、細胞質および核内に局在すると考えられます。

PHMB とインキュベートした S. cerevisiae の共焦点イメージング。 S. cerevisiaeをPHMB-ローダミン(4μg/ml)で室温で4時間処理した。細胞をDAPIおよびCon A-Alexa Fluor 488で対比染色し、共焦点顕微鏡で画像化しました。上のパネル: SRRF による画像処理前 (左) と後 (右) の共焦点画像。左下のパネル: S. cerevisiae の共焦点 Z スタックの断面図 (59 スライス)。画像は、細胞質ゾル内でのPHMB-ローダミンの蓄積と核との共局在（DAPI）を示しています。グラフは、PHMB-ローダミンの細胞内蓄積が高いことを確認します。

PHMB とインキュベートしたカンジダアルビカンスの共焦点イメージング。 C. albicans を PHMB-ローダミン (4 μg/ml) で室温で 4 時間処理しました。細胞をDAPIおよびCon A-Alexa Fluor 488で対比染色し、共焦点顕微鏡で画像化しました。上のパネル: SRRF による画像処理前 (左) と後 (右) の共焦点画像。左下のパネル: C. albicans の共焦点 Z スタックの断面図 (35 スライス)。画像は、細胞質ゾル内でのPHMB-ローダミンの蓄積と核との共局在（DAPI）を示しています。グラフは、PHMB-ローダミンの細胞内蓄積が高いことを確認します。

ポリヘキサメチレンビグアニドは、広域スペクトルの抗菌活性を持つカチオン性ポリマーです。 PHMB の抗菌メカニズムを解明するためのこれまでの研究は、PHMB の抗菌メカニズムに焦点を当ててきました 13、14、17。当初、抗菌機構は細胞膜破壊によって媒介されると考えられていました 13,14。しかし、現在の理解では、PHMB が細菌細胞に侵入し、そこでポリマーが細菌の染色体に結合して凝縮し、細胞分裂の停止と死を引き起こすと考えられています 17。したがって、この研究では、ポリマーの抗真菌メカニズムを解明しようとしました。

すべての膜透過性およびイメージングアッセイに使用する薬剤の適切な濃度を決定するために、PHMB、PHMB-ローダミン、ポジティブコントロール Triton x-114、およびネガティブコントロールテルビナフィンの MIC を最初に求めました。 SYTOX green アッセイを使用して、4 つの真菌種 (S. cerevisiae、C. albicans、F. oxysporum、P. glabrum) における初期ステップとしての細胞膜透過性の重要性を決定しました (図 1)。 SYTOX グリーンは、健康な細胞からは排除されるカチオン性色素ですが、他の薬剤による膜透過性により細胞に侵入することができ、そこで DNA に結合して蛍光シグナルを生成します。観察された細胞膜透過性は、曝露時間とPHMB濃度の両方に依存しているようでした。特に、酵母種 (S. cerevisiae および C. albicans) は、糸状菌 (F. oxysporum、P. glabrum) と比較して、MIC50 での PHMB 処理後の 15 分の PHMB 細胞透過性およびその後の蛍光の大幅な増加を示しました (図. 1）。蛍光強度はまた、すべての真菌種についてそれぞれの MIC50 値に近い PHMB 濃度でピークに達し、その後蛍光シグナルが減少するように見えました (図 2、4)。この MIC90 付近および MIC90 以上での蛍光の突然の消失は、細菌でも以前に観察されています 17。これは、膜透過性の増加はSYTOX Green:DNA蛍光の増加をもたらすはずであるため、膜透過性がポリマーの唯一の作用機序ではないことを示唆しています。 SYTOX green と同様に、PHMB は DNA16 に結合する能力があるため、蛍光の損失はおそらく競合結合によるものと考えられます。したがって、高濃度では、PHMB が真菌細胞核に入り DNA に結合し、SYTOX グリーン結合を妨げ、測定された蛍光シグナルを消光します。

前述したように、糸状菌種 F. oxysporum および P. glabrum は、MIC50 での PHMB 処理後に蛍光シグナルの有意な増加を引き起こしませんでした (図 1)。この観察は、細胞膜破壊を介して殺傷効果を誘発する界面活性剤 Triton X-114 ポジティブコントロールで処理した細胞でも認められました 26。したがって、表１のＰＨＭＢＭＩＣによれば、真菌の感受性および初期透過化機構は、真菌細胞表面へのＰＨＭＢの接近可能性によって影響されるようである。酵母と糸状菌は、細胞表面構造が重複しているだけでなく、明確な違いを共有しています。

一般に、真菌の細胞壁は、進化的に保存された内層と不均一な外層の 2 層で構成されています。内部の不溶性層は、真菌の細胞壁の剛性に必要なキチン、β-(1,3)-グルカン、β-(1,4)-グルカンなどの炭水化物で構成されています27。一方、外層は主にマンノースタンパク質を含むグリコシル化タンパク質で構成されており、これらはβ-(1,3)-グルカンキチンマトリックスに共有結合しており、またリン酸化されています28。キチンマトリックスのリン酸化は真菌の表面にアニオン電荷を与え、これにより細胞壁の不安定化とそれに続く細胞膜の透過性のためにカチオン性PHMBとの静電相互作用が可能になります。これを図２および図３に示す。図２、３では、ＰＨＭＢが経時的に酵母真菌細胞膜を透過化する。

対照的に、一部の糸状菌は細胞壁の外層にα-(1,3)-グルカンを含んでいますが、これは S. cerevisiae、C. albicans およびその他のさまざまな酵母の細胞壁には存在しません 27,28。糸状菌の細胞壁にα-(1,3)-グルカンが存在すると、アスペルギルス属の発芽分生子の凝集が誘導されることが示されています。およびペニシリウム属２９。さらに、細胞外マトリックスの存在は「バイオフィルムのような」保護を与え、PHMB が細胞膜にアクセスして抗真菌効果を発揮する能力を遅らせる可能性があります 30。

真菌への PHMB の取り込みは曝露時間と濃度の影響を受けるため、S. cerevisiae、C. albicans および F. oxysporum について、ポリマーの取り込み速度と 30 °C での完全な透過化に必要な曝露時間を決定しました（図 1）。 5、表2)。 30℃での取り込み速度は、F. oxysporum、S. cerevisiae、C. albicans についてそれぞれ 0.03775 μg/ml min-1、0.03177 μg/ml min-1、0.04607 μg/ml min-1 と計算されました（表 2）。）。 PHMB 濃度が MIC90 を超えると、すべての真菌種について細胞膜の透過性が時間 0 で急速に始まります。 PHMB MIC50 での最大透過に必要な時間は、酵母種と比較して F. oxysporum の方が有意に長かった。前述したように、これはおそらく、糸状菌種の細胞外マトリックスに結合するポリマーによるものであり、菌類の膜におけるPHMBの局所濃度を効果的に減少させる。

PHMB の細胞内蓄積を確認するために、固定した S. cerevisiae および C. albicans に対して共焦点画像解析を実行しました。 Zスタックイメージングによって撮影された酵母細胞の断面では、S. cerevisiaeとC. albicansの両方におけるPHMBの細胞内蓄積が確認されました（図6、7）。核はまた、DAPI 染色の低下を伴って断片化しているように見えました。染色体凝縮のための PHMB の DNA への結合親和性は、DNA が細胞質内でよりアクセスしやすい原核生物で以前に観察されています 7,17。対照的に、哺乳類の真核細胞では。 PHMB は核膜から隔離され、エンドソーム内に保管されて廃棄されます 7。したがって、哺乳動物細胞と真菌細胞の真核生物分類は共通であるにもかかわらず、ポリマーは微生物細胞と非微生物真核細胞を機構的に区別して細胞侵入を促進します。この違いは、真菌と哺乳類の膜脂質組成の違いによるものと考えられます。 PHMB の哺乳動物細胞エンドソームへの隔離とその後の除去は、in vitro の抗真菌効果と一般的な細胞傷害効果の間に大きな治療領域がある理由を説明しています。

初期エンドソームは細胞膜と同じ脂質組成を共有していることが一般に受け入れられています。哺乳類のエンドソーム膜は、ホスファチジルコリン (> 50%、正味電荷なし)、ホスファチジルエタノールアミン (正味電荷なし)、ホスファチジルセリン (-ve 電荷)、ホスファチジルイノシトール (-ve 電荷)、およびホスファチジン酸 (-ve 電荷) で構成されています。真菌のエンドソーム膜もこれらのリン脂質で構成されていますが、その割合は異なります。たとえば、S. cerevisiae の細胞膜にはホスファチジルセリン (約 30%) とホスファチジルイノシトール (約 27%) が多く含まれているため、より強い正味の負の膜電荷を持っています 32。これは、PHMB の抗菌性の区別が、カチオン性ポリマーとアニオン性リン脂質の間の静電相互作用の強さによって引き起こされる可能性があることを示唆しています。

さらに、プロット分析 (図 6、7) では、両種の細胞質に比べて低濃度で細胞膜上に PHMB が存在することも示されました。 PHMB の膜蓄積が少ないことは、細胞膜透過性が唯一の抗真菌機構ではないという主張をさらに強めます。一般に、膜の蓄積は、アムホテリシン B やその他の膜透過性薬剤などの膜透過性薬剤で観察されますが、ここでは観察されていません 33。

その結果、PHMBはエンドソームに捕捉されることなく、膜透過性を介して真菌細胞に自由に侵入すると思われます（図8）。細胞に侵入すると、細胞質内に蓄積し、その後核を破壊して DNA に結合します。観察された核破壊は、核膜と小胞体膜が連続しているため、PHMB の他の潜在的な細胞内標的が存在することを示唆しています。さらに、細菌と同様に、酵母のミトコンドリアも元は原核生物です。したがって、PHMB と他の細胞小器官との潜在的な相互作用にはさらなる研究が必要です。

PHMBに対する酵母および糸状菌のさまざまな感受性の概略図。 (A) 細胞壁がアニオン性であるため、酵母細胞は PHMB 攻撃を受けやすく、ポリマーの接着が可能です。さらに、出芽中にβ-(1,3)-グルカンとキチンマトリックスが露出し、PHMB細胞の侵入を促進する可能性があります。 (B) 糸状菌は、細胞外マトリックス (ECM) の存在により、PHMB 攻撃の影響を受けにくいようです。 ECM はポリマーを効果的に結合することで、PHMB を「掃討」するためのバイオフィルムのような保護を与えます。真菌の細胞膜における局所濃度を減少させます。 PHMB の浸透と菌糸/分生子柄のアクセス可能性。しかし、分生子の発芽中に細胞壁のα-1,3が露出し、分生子の負電荷が増加するため、カチオン性PHMBの殺菌活性が増加します。

PHMB は真菌の細胞膜にアクセスし、そこで静電相互作用を通じて細胞膜と相互作用し、透過化のプロセスを開始します。細胞膜が破壊された後、細胞質ゾル内に蓄積し、そこで核膜を破壊し、DNAに結合してさらなる断片化を引き起こします。 4 つの真菌種が分析されましたが、それらは 2 つの大きな真菌科、すなわちサッカロマイセ科とネクトリア科に属しています。したがって、観察されたPHMBとの相互作用は、より広い真菌属を反映しています。この研究は、耐性のリスクが低い代替抗真菌薬としての PHMB の非特異的な作用機序についてのより良い理解を提供します。ただし、真菌の細胞壁の脆弱性の程度と他の細胞小器官との相互作用はまだ評価されていません。

現在の研究中に生成されたデータセット、および/または現在の研究中に分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、共焦点および蛍光イメージングでの支援をいただいた Andrew Hibbert 博士 (RVC) と、原稿のレビューと批判的なフィードバックの提供を支援してくださった David Cook 博士 (Blueberry Therapeutics Ltd.) に感謝したいと思います。

この研究は、BBSRC、ロンドン学際的博士課程研修プログラム (LIDo) (プロジェクト参照: 1906777、助成金番号 BB/M009513/1)、および Blueberrytherapys Ltd から資金提供を受けました。さらに、著者全員は現在、バイオテクノロジー企業である Tecrea Ltd の従業員です。 PHMB を使用したナノデリバリーを可能にする王立獣医大学からの研究です。

病理生物学と人口科学、王立獣医大学、ロンドン、イギリス

ウィニー・ノース・ボアズ、イザベル・パパンドロニコウ、ジョセフス・ミキュロブ、リアム・グッド

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WNB がデータ分析を主導し、データ収集を監督し、原稿を執筆しました。 WNB と IP は最小発育阻止濃度アッセイを実施しました。 IP は、SYTOX グリーン透過化アッセイと真菌を使用した PHMB の蛍光イメージングを実行しました。 JM は、真菌における PHMB 蓄積の共焦点イメージングを実行しました。 LGは本作のコンセプト設計、取材監修、原稿の改訂を担当した。

ウィニー税務官への通信。

著者全員は現在、王立獣医大学からスピンアウトしたバイオテクノロジー企業である Tecrea Ltd の従業員であり、PHMB を使用したナノデリバリーを可能にしています。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Ntow-Boahene, W.、Papandronicou, I.、Miculob, J. 他真菌細胞の障壁と細胞小器官は、ポリヘキサメチレンビグアニド (PHMB) によって破壊されます。 Sci Rep 13、2790 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29756-w

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受信日: 2022 年 9 月 12 日

受理日: 2023 年 2 月 9 日

公開日: 2023 年 2 月 16 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29756-w

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