加熱不十分のハンバーガーから回収されたネズミチフス菌 UcB5 由来の推定細胞毒性セリン プロテアーゼ

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3926 (2023) この記事を引用

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UcB5と命名された推定毒性エキソプロテアーゼは、フェニルセファロース6FF、DEAEセファロースCL-6Bを用いた疎水性、イオン交換、およびゲル浸透クロマトグラフィーにより、電気泳動均一性まで13.2倍および17.1%の回収率でネズミチフス菌から精製することに成功した。 、セファデックス G-75 をそれぞれ使用します。 SDS-PAGEにより分子量は35kDaであることを確認した。 至適温度、pH、等電点はそれぞれ35℃、8.0、5.6±0.2であった。 UcB5 は、試験したほぼすべての発色基質に対して幅広い基質特異性を有し、N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA に対して最大の親和性を示し、Km 0.16 mM、Kcat/Km 3.01 × 105 S−1 M を達成しました。 −1、アミド分解活性は28.9μmol min−1 L−1。 これは、TLCK、PMSF、SBTI、およびアプロチニンによって大幅に阻害されましたが、DTT、β-メルカプトエタノール、2,2'-ビピリジン、o-フェナントロリン、EDTA、およびEGTAは影響を及ぼさなかったことから、セリンプロテアーゼタイプが示唆されました。 また、血清タンパク質を含む広範囲の天然タンパク質に対して幅広い基質特異性を示しています。 細胞毒性と電子顕微鏡研究により、UcB5 が細胞内タンパク質分解を引き起こし、最終的に肝臓壊死を引き起こす可能性があることが明らかになりました。 このため、将来の研究では、微生物疾患の治療に薬物を単独で使用するのではなく、外部の抗プロテアーゼと抗菌剤を組み合わせて使用​​することに焦点を当てる必要があります。

毒素と酵素は、病気の宿主内での微生物の病因において重要な病原性物質として機能します1、2。 細菌毒素は十分に特徴づけられており、病因形成過程におけるその役割はよく研究されていますが、動物や植物の病因における微生物プロテアーゼの役割は十分に研究されていません。 これは、酵素の複雑さと毒素と比較した選択性の欠如の結果である可能性があります3。 プロテアーゼは、多くの病原性細菌の細胞抽出物中でずっと前に同定されています4。 それらの大部分は長い間正体不明であり、完全に定義されたのはつい最近であると知ると驚くかもしれません。 微生物は、セリン、メタロ、アスパラギン酸、システイン タイプに分類される多くのタイプのプロテアーゼを生成します。 それらの一部はセルピンとして知られる血漿プロテアーゼ阻害剤によって特異的に阻害されますが、それらのほとんどは耐性があるか、ヒト血漿アンチプロテアーゼを不活化します。 その結果、これらが体内に入ると、病気の進行と宿主の機能障害が加速されます5。

毒性へのそれらの関与は、さまざまな方法と関連付けられています。 侵入プロセスを開始したり、宿主タンパク質を消化してペプチド栄養素にアクセスしたりするには、まず宿主組織をタンパク質分解して破壊します。 例えば、HtrA プロテアーゼは、細胞シグナル伝達タンパク質やマトリックス成分のタンパク質分解を妨害することにより、まず病気の蔓延を促進します。 第二に、結合部分 (B サブユニット) から活性部分 (A サブユニット) を切り離すことにより、サブユニット毒素 (AB 毒素) を活性化する可能性があります。 第三に、Clp プロテアーゼや Lon プロテアーゼなどの一部は、病原性制御因子を適切なタイミングで破壊することによってサイトゾル内で直接的に作用し、スーパーオキシドやフリーラジカルなどの内部拮抗成分に対する耐性を提供することによって間接的に作用して、感染ウイルスに対する宿主の免疫エフェクター成分を阻止します。細菌性病原体6.

2,000 を超える血清型を持つ S. enterica は、さまざまな病気を引き起こす可能性があります。 腸炎菌血清型とネズミチフス血清型はヒトの胃腸炎の最も一般的な原因ですが、腸チフス菌のような他の血清型は致命的な全身性疾患の根本的な原因です。 興味深いことに、clpP または clpX プロテアーゼを欠く血清型ネズミチフス菌変異体は非毒性株であることが判明し、サルモネラ症における ClpXP プロテアーゼの重要性を示しています 7。 さらに、Lon プロテアーゼを欠く血清型変異体は H2O2 と酸性度に非常に敏感であるため、マクロファージ内に存続して体の遠位部分で増殖して疾患を引き起こすことができません 8。 ネズミチフス菌血清型のペプチダーゼ N は、広範囲の基質活性を持つサイトゾル内の主要なアミノペプチダーゼであることが判明しました 9。

現時点でも、サルモネラ菌血清型によって引き起こされる感染症は依然として危険であり、特に低中所得国では多くの汚染された食品と一緒にサルモネラ菌を摂取する可能性があり、消化管内に局所的な病理学的状態を引き起こし、それが広範囲に広がる可能性があります。全身感染症10． 残念ながら、サルモネラ菌プロテアーゼの詳細な特徴付けは不足しているため、我々は主に、地元の食品サンプルに付随するサルモネラ菌およびシゲラ分離株のタンパク質分解活性および溶血活性を監視することを目的としていました。 研究のこの部分の目標は、最も強力な分離株であるネズミチフス菌によって産生される UcB5 プロテアーゼによる哺乳動物細胞の酵素特性と細胞変化を明らかにするために拡張されました。

DTT、SBTI、および EAM は Merck (中国、北京) から入手しました。 フィブリン、フィブリノーゲン、pNA、PMSF、DMSO、EGTA、PHMB、ロイペプチン、およびペプスタチン A は Sigma-Aldrich (ミズーリ州、米国) から購入しました。 D-Val-Leu-Arg-pNA (V6258)、D-Val-Leu-Lys-pNA (V7127)、D-Phe-Pip-Arg-pNA (P7027)、N-Succ-Ala などの発色合成基質-Ala-Pro-Phe-pNA (S7388) も Sigma-Aldrich から購入しました。 HT29 ヒト腺癌細胞株は、Merck (ダルムシュタット、ドイツ) から購入しました。 フェニルセファロース 6FF、DEAE セファロース CL-6B、セファデックス G-75、およびマーカータンパク質は、Amersham Biosciences (スウェーデン) から購入しました。 残りの化学物質は、居住者が提供した分析グレードのものでした。

研究中の細菌株は、もともと地元の伝統的な市場から購入した加熱が不十分なビーフバーガーのサンプルから回収されました。 この菌株は、加工肉や乳製品を含むさまざまな食品サンプルから回収された合計 14 種類の細菌分離株の中で最も高いタンパク質分解活性と溶血活性を示しました。 これらの細菌の分別分離は、pH 7.0 の 1% スキムミルクを補充したサルモネラ赤癬 (SS) 寒天プレート (Himedia、インド) 上で実行されました。 その後、皿を 37 °C で 48 時間インキュベートしました。 コロニーを囲む透明なハローは、タンパク質分解活性を示しています。 溶血活性のスクリーニングには、10% クエン酸塩添加羊血を添加した SS 寒天を使用しました。 細菌コロニーを囲むハローゾーンは溶血活性を示していた。 このスクリーニングプログラムに基づいて、加熱が不十分なビーフバーガーサンプルから分離された分離株番号5が選択され、16SrDNA遺伝子フィンガープリントを使用して種レベルまで同定され、GenBankデータベースでBLAST分析が実行されました。 短期細菌培養物は栄養寒天上で 4 °C で保存されましたが、長期培養物は 20% (v/v) グリセリン化ブロス中で -80 °C で保存されました。

株番号ＵｃＢ５の接種材料を、ＮａＣｌ ５．０（ｇ／Ｌ）、酵母エキス５．０、およびトリプトン１０．０（ｐＨ７．０）からなるＬＢブロス中で定期的に継代培養した。 正確に、12 時間経過した接種材料 (約 3 × 108 cfu/mL) の 1 パーセント (v/v) が、pH 7.0 の発酵ブロスに輸送されました。 基本培地は、(w/v) 1% フルクトース、0.5% NaCl、0.5% ペプトン、0.15% MgSO4・7H2O、0.08% KH2PO4、0.02% K2HPO4、0.005% CuSO4 および 0.001% FeSO4 から構成されました。 インキュベーションは、50 mL のブロスを入れた 250 mL 三角フラスコ中で、毎分 150 回転の振盪速度下、37 °C で 48 時間実施しました。

タンパク質分解活性は、培養上清 1 mL と、pH 7.0 の 0.2 M Tris-HCl 緩衝液に溶解した 1% (w/v) アゾカゼイン溶液 1 mL を混合することによって評価しました。 酵素 - 基質反応を 37 °C で 30 分間進行させ、2 mL の 10% (w/v) トリクロロ酢酸溶液を添加して終了させました。 その後、砕いた氷浴中で 60 分間インキュベートします。 この計算に従って、可溶性分解タンパク質の量 (C) が測定されました (mg/mL)。 C (mg/mL) = 1.55 OD280 − 0.76 OD260。 タンパク質分解酵素活性の 1 単位 (1 U) は、標準的な実験条件での反応 1 ミリリットルあたり 1 分間に放出される l-チロシン 1 マイクログラムに相当します。

粗プロテアーゼを、(NH4)2SO4 塩沈殿、フェニルセファロース 6FF 疎水性クロマトグラフィー、DEAE セファロース CL-6B 陰イオン交換クロマトグラフィー、およびセファデックス G-75 ゲル浸透クロマトグラフィーを含む 4 段階を通して、4 °C で冷却しながら精製しました。 最初に、培養ブロスを 7000 xg で 10 分間遠心分離し、次に 30 ～ 70% 飽和の (NH4)2SO4 の添加を実行しました。 10,000 xgの速度で15分間遠心分離して、可溶性タンパク質を収集します。 次いで、ペレット化した粗プロテアーゼおよび他のタンパク質を緩衝液Ａ（１．０Ｍ）ＮＨ ４ ） ２ ＳＯ ４ を含む２０ｍＭのトリス－ＨＣｌ中にｐＨ７．８で再懸濁した。 懸濁物質の除去および透析ステップの後、濃縮された粗プロテアーゼを 1.5 × 20 cm2 寸法の Phenyl Sepharose 6 FF カラムにロードしました。 その後、緩衝液 A 中の 0.5 ～ 0.0 M (NH4)2SO4 の直線上昇を適用してタンパク質を溶出しました。 この溶出クロマトグラムから、酵素活性を示す活性画分をプールし、濃縮した。 次に、1.5 × 15 cm2 寸法の DEAE-Sepharose CL-6B からなる次のカラムにロードします。 溶出は、20 mM Tris-HCl 緩衝液 (緩衝液 B) を使用し、pH 9.4 で 0.5 mL/min の流速で行われました。 次いで、タンパク質分解活性を示す活性画分を濃縮し、緩衝液Bで透析し、1.5×30cm2寸法のSephadex G-75 FFを含む次のカラムにロードした。 溶出はバッファー A で行いました。最終プロテアーゼ活性画分を凍結乾燥し、15% (w/v) 分離ゲルと 5% (w/v) スタッキングゲルを使用した Laemmli11 の汎用技術により SDS-PAGE を実行しました。

酵素活性に対する温度の影響は、0.2 M Tris-HCl 緩衝液、pH 7.0 中の 1% (w/v) アゾカゼインを使用して 20 ～ 65 °C で検査されました。 一方、熱安定性を調べるために、0.2 M Tris-HCl (pH 7.0) 中の試験対象プロテアーゼ溶液を 20 ～ 65 °C で 60 分間放置しました。 インキュベーションの終了までに、酵素アッセイの典型的な設定で残っているプロテアーゼ活性を測定するために、処理物を冷却しました。

UcB5 のタンパク質分解活性に対する pH の影響を研究するために、反応溶液を 3 つの緩衝液によって広範囲の pH に固定しました。 クエン酸 - リン酸緩衝液は 3.0 ～ 6.0 の範囲の pH を実現し、トリス - 塩酸緩衝液は 7.0 ～ 8.0 の範囲の pH に対応し、グリシン - NaOH 緩衝液は 9.0 ～ 13.0 の範囲の pH を調整します。 1% (w/v) 濃度のアゾカゼインを使用し、酵素 - 基質反応のインキュベーションを 35 °C で行いました。

純粋な酵素の pH 安定性を研究するために、規定の緩衝液を使用して、5.0 ～ 13.0 の範囲のさまざまな pH で 35 °C で 60 分間インキュベートしました。 残りの酵素活性をpH 8.0で評価しました。 さらに、試験したプロテアーゼの等電点は、純粋な酵素の濃縮調製物を、pH 3.0 ～ 11.0 の範囲、4 ℃で一晩インキュベートすることによって決定されました。 タンパク質の沈殿は、10,000×gの重力で15分間行われました。 タンパク質ペレットをBradford12法に従って定量した。 等電点は、タンパク質の沈殿が最大になる pH 度として表されました 13。

これらは、P7021、V7127、S7388、および V6258 などの合成基質としてのいくつかの発色ペプチドに対して比色定量的に決定されました。 実験のために、マイクロプレートの各ウェルに、20 mM Tris-HCl 緩衝液（pH 8.0）中の酵素溶液 5 μl、および 0.02 ～ 0.15 mM の特定の濃度の合成基質 100 μl をロードしました。 反応は37℃で行い、一定時間間隔で1.4mlの0.15Mトリクロロ酢酸を添加して停止させた。 放出された pNA の量は、A405 nm で分光測光的に推定されました。 プロテアーゼのアミド分解活性の 1 単位 (1 U) を、試験したプロテアーゼの作用により 1 分あたり mL あたり分解される発色基質の nmol に換算しました。 速度論的パラメーターは、酵素反応の初速度に応じて Lineweaver-Burk プロットから推定されました。

精製された UcB5 が属するグループを定義するために、そのアミド分解活性に対するさまざまな金属イオンおよび標準試薬の影響が調査されました。 マイクロプレート内で、これらを 100 μl の 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 緩衝液中の 1.0 × 10-4 mg の発色基質 S7388 および 2.0 × 10-3 mg の酵素と混合し、37 ℃で 3 分間インキュベートしました。 ℃。 放出された pNA は、A405 での分光光度測定によって定量されました。

金属イオンの実験では、5 mM の濃度で並行してテストしました。 プロテアーゼ試薬の適用濃度は、引用文献に従って異なりました (結果を参照)。 試薬とカチオンを含まない処理における酵素活性を 100% とみなしました。

天然タンパク質基質に対する UcB5 の基質特異性は、Peng et al.14 の手順に従って 0.5% (w/v) 濃度で研究されました。 これらには、カゼイン、エラスチン、ヘモグロビン、フィブリン、ゼラチン、フィブリノーゲン、コラーゲン、ムチン、IgG、血清アルブミンが含まれます。 これは、いくつかの天然タンパク質に対して測定されました。 タンパク質分解活性の 1 単位 (1 U) は、アッセイの標準条件下で 1 ミリリットルあたり 1 μmol に匹敵するアミノ酸チロシンを放出する酵素の量として校正されました。

次の実験は適切な機関によって承認されました。 これに加えて、すべての方法は、ARRIVE ガイドラインを含む関連ガイドラインおよび規制に従って実行されました。 インビトロ抗凝固活性は、15 μg/ml の UcB5 プロテアーゼの存在下でのヒト血清の凝固期間の増加として調べられました15。 正確に、100 μl の血清を等量のトロンボプラスチンおよびカオリンとボルテックス混合しました。 水浴中で37℃で2分間インキュベートした後、正確に100μlの0.3% (w/v) CaCl2および100μlの酵素を添加した。 次に、精製酵素の代わりに等量の生理食塩水を含むブランクと比較して、酵素の存在下での凝固時間を測定した。

HT29 ヒト腺癌細胞株 (Merck、ダルムシュタット、ドイツ) に対するネズミチフス菌の精製プロテアーゼの in vitro 細胞毒性アッセイを、96 ウェル プレート上で 24 時間インキュベートして実施しました。 1 ミリリットルあたり 1 × 105 HT29 細胞あたり、15 マイクログラムの酵素が使用されました。 インキュベーションの終了までに、HT29 の細胞死のパーセントが標準的な MTT アッセイによって評価されました 16。 ネガティブブランクには活性プロテアーゼ調製物の代わりに生理食塩水を使用し、ブランクには細胞を含まない培地を使用した。 このアッセイの考え方は、残った生存細胞が黄色のテトラゾリウム MTT 試薬を、A540 nm に特徴的な吸収を持つ紫色のホルマザン複合体に変換できるため、HT29 の生存率を示すというものです。 紫色の強度は、UcB5 に曝露した後の生存細胞の数に直接関係します。

さらに、精製酵素による赤血球に対する細胞損傷活性（溶血活性）のアッセイを行った。 これは、同じ体積サイズの 15 μg プロテアーゼ/mL と 0.1 M ホウ酸緩衝液、pH 7.5 に懸濁した 4% (v/v) 洗浄ヒト RBC をボルテックスすることによって達成されました。 37℃で90分間インキュベートし、その後、放出されたヘモグロビンの量を比色分析により測定した。 比較のために、RBC 懸濁液と 1% (v/v) トリトン X-100 溶液を混合することによって完全な溶血処理を行いました。

また、細胞損傷活性の in vivo スクリーニングが行われ、LD50 値が計算されました。 このために、体重 22 ～ 25 g の BALB/c マウスを実験室条件に 1 週​​間順応させ、比較的固定された栄養条件および身体条件に維持しました。 次に、それらをケージあたり 6 匹ずつ 6 つのグループに分けました。 最初のグループはユニバーサル ブランク グループとして表されました。 この群のマウスには、60μg/体重の濃度で等量の熱変性酵素製剤を腹腔内接種した。 一方、他の 5 つのグループには、総量 1 ml の溶液中のさまざまな濃度 (60、30、15、8、および 4 μg プロテアーゼ/体重) の活性プロテアーゼ調製物を腹腔内注射しました。 次に、Karber の方法に従って LD50 を計算するために、動物を 48 時間にわたって時間間隔で観察しました。 罹患マウスおよびブランクマウスの肝臓は、死後即座に摘出され、5% (v/v) グルタルアルデヒド、次に 1% (w/v) OsO4 溶液で固定されました。 ブランクマウスを解剖する前に、吸入ガスのセボフルランによって麻酔をかけた。 70 nm の超薄切片を RMC ウルトラミクロトームでスライスし、JEOL 1010 TEM での検査のために銅製の標準グレードの TEM サポート グリッドに載せました。

特に明記しない限り、すべての測定と処理は 3 回繰り返して実行されました。 統計分析は SPSS Statistics V24 ソフトウェアによって行われました。 最終的な測定値は、平均値 ± 標準偏差の形式で表されました。

in vivo研究は、エジプトのカフレルシェイク大学の実験動物管理倫理委員会からの許可番号5/2019ECに基づいて行われました。 これに加えて、すべての方法は、ARRIVE ガイドラインを含む関連ガイドラインおよび規制に従って実行されました。

タンパク質分解活性と溶血活性の両方を発揮するサルモネラ菌および/またはシゲラ分離株の予備調査中に、スキムミルクを補充した SS 寒天培地上で合計 14 個の分離株を分離しました。 これらは元々、いくつかの地元の市場から収集した 30 個の食品サンプルから得られたものです。 それらの中で最も強力な生産菌は、加熱が不十分なビーフバーガーサンプルから分離された分離株番号 5 でした。 したがって、これをＵｃＢ５株と命名した。 16SrDNA 遺伝子配列データと BLAST 分析により、UcB5 株は既存の属および種と 98.86% の類似性を有するネズミチフス菌であることが示されました。 ヌクレオチド配列は、アクセッション番号 (MH340533.1) で GenBank Records Library にリストされました。

細菌の増殖と最も強力な菌株からの UcB5 プロテアーゼ生成は、発酵期間全体 (96 時間) にわたって同期していました。 それらは 48 時間のインキュベーションで最大レベルに達し、そこで細菌の増殖は波長 600 nm での光学密度 1.32 に達し、酵素生産性は 125.2 U/mL に達しました (図 1)。

(w/v) 1% フルクトース、0.5% ペプトン、0.5% NaCl、 0.15% MgSO4・7H2O、0.08% KH2PO4、0.02% K2HPO4、0.005% CuSO4 および 0.001% FeSO4。 発酵は、37 °C、初期 pH 7.0 で 150 rpm の回転振盪機で 48 時間行いました。 相関係数 r = 0.886*** であるため、細菌の増殖と酵素の生産性の間には高い正の相関関係があります。 両側 P 値は 0.00 として与えられ、これにより非常に有意な線形相関が得られます。

表 1 に概要を示したように、UcB5 酵素は、フェニル セファロース 6FF、DEAE セファロース CL-6B、およびそれぞれセファデックス G-75。 酵素の最終比活性は 13.2 倍、回収率は 17.1% に増加しました。 試験した酵素の電気泳動の均一性は、最後のクロマトグラフィー段階で得られた画分 18 ～ 42 を含むプロテアーゼ活性の主要ピークから反映されました。 これらの画分を濃縮した後、SDS-PAGEを行ったところ（図2a）、35 kDaに顕著なバンドが示されました（図2b）。 SDS-PAGE ゲルの以前のバージョンは補足図 S1 に示されています。

Sephadex G-75 (a) および SDS-PAGE (b) による UcB5 の溶出プロファイル。 最初に、培養タンパク質を 30 ～ 70% 濃度の硫酸アンモニウムで沈殿させ、次に Phenyl Sepharose 6FF カラム (1.5 × 20 cm2) にロードし、続いて DEAE-Sepharose CL-6B カラム (1.5 × 20 cm2) にロードしました。 Sephadex G-75 FF カラム (2.5 × 100 cm2)。 最後に、5% (w/v) スタッキング ゲルと 15% (w/v) 分離ゲルを使用して SDS-PAGE 分析を実行しました。 ゲルはペイント ソフトウェアでトリミングされ、以前のバージョンのゲルは補足情報ファイルにあります。

基質アゾカゼインに対する UcB5 のタンパク質分解活性の最適反応温度は 35 °C であることが検出されました (図 3)。 さらに、酵素は 55 °C 以下で 60 分間熱的に安定でした。 50 °C で初期活性の 84% を保持しました。 基質に対するUcB5のタンパク質分解活性にとって理想的なpHは、pH 8.0で確立されました（図4a）。 さらに、UcB5のpH安定性は8.0〜11.0で60分間見られました（図4a）。 pH 8.0 ～ 11.0 では、酵素は元の活性の 92% を保持しました。 タンパク質の沈殿によって反映されるように、この酵素のタンパク質構造の等電点は pH 5.6 ± 0.2 で見つかりました。 沈殿レベルは 1.8 mg タンパク質/mL に達しました (図 4b)。

タンパク質分解活性 (-●-) と安定性 (-○-) の両方に対する温度の影響。 酵素活性に対する温度の影響は、基質アゾカゼインを使用し、0.2 M Tris-HCl 緩衝液を使用して pH 7.0 でテストされました。 UcB5 の温度安定性は、基質なしで 0.2 M Tris-HCl (pH 7.0) 中で 60 分間インキュベートすることによって研究されました。 インキュベーションの終了までに、残っている活性を評価しました。 相関係数 r = 0.738** であるため、酵素活性とその熱安定性の間には高い正の相関関係があります。 両側 P 値は 0.015 として与えられ、これにより非常に有意な線形相関が得られます。 一方、酵素の安定性と温度の間には、相関係数 r = − 0.915*** から明らかな非常に負の相関関係があります。 両側 P 値は 0.000 として与えられ、これは非常に有意性の高い線形相関をもたらします。 推定された回帰式は、酵素の安定性 = 139.9 ～ 1.47 温度として表すことができます。

タンパク質分解活性 (-●-) と安定性 (-○-) の両方に対する pH の影響 (a)。 アゾカゼインの存在下で反応温度を35℃に調整した。 純粋な酵素の pH 安定性は、基質なしで 35 °C で 60 分間、さまざまな pH でインキュベートすることによって検査され、その後、残りの酵素活性が pH 値 8.0 で評価されました。 タンパク質沈殿パターンに基づく等電点 pH を (b) に示します。 相関係数 r = 0.487 であるため、酵素活性とその pH 安定性の間には弱い正の相関関係があります。 両側 P 値は 0.109 として与えられます。 相関係数 r = − 556*** であるため、pH と沈殿タンパク質の間には弱い負の相関関係があります。 両側 P 値は 0.000 として与えられ、推定回帰式はタンパク質含有量 = 1.522 ～ 0.122 pH として表すことができます。

我々の結果は、この酵素が、試験した発色基質に対して異なる程度のアミド分解活性を示すことを示した(表2)。 キモトリプシンおよびズブチリシンプロテアーゼの標準プロテアーゼ基質である N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA は、UcB5 によって最も分解された基質であり、28.9 μmol min-1 L-1 のアミド分解活性を示しました。 また、UcB5 は発色基質 D-Val-Leu-Lys-pNA および D-Phe-Pip-Arg-pNA を分解しました。 ただし、D-Val-Leu-Arg-pNA に対しては最も低い作用を示しました。 N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 基質に対する UcB5 の反応速度パラメータは次のとおりです。 Kmは0.16mM、Kcat/Kmは301mM-1S-1。

酵素活性に対するプロテアーゼ試薬とカチオンの影響を研究することにより (表 3)、試験した酵素の性質、活性部位の性質、および補因子の供給についての最初の理解が得られます。 アミド分解活性に対するカチオンの影響を調査したところ、それらのいずれも酵素の活性化因子ではないことが判明しました。 金属の非存在下でのアミド分解活性を 100% とみなしたため、相対活性は Ba2+ で 92%、Co2+ で 87%、Zn2+ で 62%、Fe3+ で 102%、Ca2+ で 84%、Mg2+ で 98%、65% でした。 Cu2+ の場合は %、Mn2+ の場合は 49%、Cd2+ の場合は 67%、Ag2+ の場合は 103%、Hg2+ イオンの場合は 47%。

プロテアーゼ試薬の影響に関して、UcB5 のプロテアーゼ活性は、TLCK (相対活性 1.2%)、PMSF (相対活性 17.3%)、SBTI (相対活性 31.3%)、アプロチニン (相対活性 3.0%) によって阻害されることが判明しました。 、ペプスタチン A (相対活性 15.7%)、およびロイペプチン (相対活性 78.5%) は影響を受けませんでしたが、2,2'-ビピリジン (相対活性 102.2%)、DTT (相対活性 100.5%)、o-フェナントロリン (99.5%) の影響を受けませんでした。相対活性）、β-メルカプトエタノール（相対活性98.9％）、および2つのメタロプロテアーゼ阻害剤EDTA（相対活性100.1％）およびEGTA（相対活性100.2％）（表2）。 さらに、我々の結果は、メルカプチド形成剤 PHMB (相対活性 99.7%) および EAM (相対活性 102.1%) がタンパク質分解活性に影響を及ぼさないことを示しました。

これは、0.5% (w/v) 濃度のいくつかの天然タンパク質に対して測定されました。 カゼインに対する UcB5 の活性を 100% とすると、フィブリン、ゼラチン、ムチン、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、エラスチン、コラーゲン、IgG、血清アルブミンに対する相対活性は 32.0、65.6、6.8、23.8、76.3、11.2、42.5、それぞれ0.0、12.7%。 血漿タンパク質に対するタンパク質分解作用は、抗凝固活性をテストする次の実験でも確認されました（補足表S1）。 UcB5の存在下では、血清の凝固時間は81秒に延長され、酵素なしの凝固時間の3.5倍に達した。

補足表S1に示すインビトロ実験中、15μg酵素/mlの用量でのUcB5は、培養HT29細胞株の63.8％の細胞死を示した。 さらに、赤血球の溶血が 3.9 倍増加しました。 さらに、その毒性と酵素活性の間に関係があるかどうかを判断するために、活性プロテアーゼ調製物と熱不活化プロテアーゼ調製物を用いた比較 in vivo 研究が実施されました。 活性製剤は、マウス体重あたり60μg〜4μgのプロテアーゼで使用されました（補足表S2）。 60 μg および 30 μg の濃度では、すべての試験動物が 2 時間以内に死亡しましたが、15 μg および 8 μg の処理では、それぞれ 6 匹中 4 匹および 1 匹が 48 時間以内に死亡しました。 酵素の 4 μg 処理では致死性は認められませんでした。 一方、熱不活化酵素製剤ではマウスは死亡しませんでした。 48 時間で計算された LD50 は、15.75 μg プロテアーゼ/マウス体重でした (補足表 S2)。

罹患マウスの TEM 研究により、UcB5 が肝細胞内で小胞形成 (V) を誘導し、ヘテロクロマチン (Hc) の蓄積により核膜 (nm) が奇形になっていることが明らかになりました。 肝細胞の細胞膜と粗面小胞体（ER）は完全に消失しました（図5）。

治療マウスと対照マウスの肝細胞の超微細構造変化を示す TEM 顕微鏡写真。 (a) 典型的な肝細胞は、ユークロマチン (Ec) を含む無傷の細胞膜 (cm) と無傷の核膜 (nm) を示します。 また、無傷の粗面小胞体 (ER) と広範囲にわたる正常なミトコンドリア (M) も示されています。 (b) UcB5 プロテアーゼの活性製剤を投与されたマウスの肝細胞。 これは、ヘテロクロマチン (Hc) を伴う小胞形成 (V) および奇形核膜 (nm) を示しています。 細胞膜と粗面小胞体の消失が見られます。 インビボでの細胞損傷活性は、6 つのグループに分けて飼育された BALB/c マウスを用いた実験によって評価されました。 簡単に説明すると、合計 1 ml の精製 UcB5 を腹腔内経路で各マウスに接種しました。 ユニバーサル対照群として、すべてのマウスに熱不活化酵素製剤を接種しました。 屠殺した動物および対照動物から肝臓を取り出し、固定した。 最後に、厚さ 70 nm の超薄切片を RMC ウルトラミクロトームで採取し、JEOL 1010 TEM での電子顕微鏡検査のために銅グリッド上に支持しました。

いくつかの発表された研究によると、病原微生物が病気を引き起こす能力は細胞外プロテアーゼの発達に依存します。 正確な作用方法は不明ですが、これらの微生物酵素は宿主のプロテアーゼシステムに干渉すると思われます17。 私たちの以前の研究では、Brevibacterium otitidis の KB76 プロテアーゼ 18 と Pseudomonas aeraginosa の ZuhP13 プロテアーゼ 17 の病因を報告しました。 この論文では、我々は細菌 S. typhimurium から UcB5 プロテアーゼと名付けられた細胞傷害性酵素の可能性を分離し、その特徴を明らかにしました。

最も効果的なプロテアーゼ産生株である UcB5 株は、16S rDNA 遺伝子配列データにより S. typhimurium として同定されました。 48 時間のインキュベーション後、UcB5 プロテアーゼの生成 (125 U/mL) と細菌の増殖は最高レベルで同期しました (図 1)。 したがって、UcB5 プロテアーゼは、緑膿菌の ZuhP13 プロテアーゼと同様、細菌の発生に必要な主要な酵素であると推測できます 17。 魚病原体のプロテアーゼとは対照的に、Yersinia ruckeri は 12 h19 で最高ランクの生産性を示しました。 興味深いことに、UcB5 は基質カゼインを含まない基礎培地で生成されました (材料と方法を参照)。これは、誘導酵素ではなく構成酵素を示しています。

単離された酵素の最終比活性は 13.2 倍増加し、回収率は 17.1% でした。 最後のカラムタンパク質の SDS-PAGE (図 2a) により、35 kDa に明確なバンドが明らかになりました (図 2b)。 この分子量は、緑膿菌の病理学的プロテアーゼ 20 と一致しますが、レジオネラ ニューモフィラ (38 kDa21)、ビブリオ ペラギウス (39 kDa22)、腸炎ビブリオ (43 kDa23)、Br のプロテアーゼとは異なります。 otitidis (47 kDa18)、および Y. ruckeri (47 kDa19)。

Y. ruckeri19 の毒性プロテアーゼとの類似性により、35 °C が UcB5 のタンパク質分解活性の最適反応温度であることが示されました (図 3)。 ZuhP13 プロテアーゼには 40 °C が最適で 17、ME4 プロテアーゼには 50 °C が最適でした 24。 さらに、UcB5 は 55 °C 以下で 60 分間熱安定性があることがわかりました (図 3)。 文献を参照すると、Y. ruckeri 毒性プロテアーゼでの評価では熱安定性が高く (55 °C で完全阻害 19)、緑膿菌の san-ai プロテアーゼと比較して温度不安定性が高くなります (60 °C で安定)。 90分25分。

UcB5のタンパク質分解活性は、pH 8.0で最高であることが示されました（図4a）。これは、Y.ruckeri19、Bacillus cereus株BG126、およびKCTC 367427株の病理学的プロテアーゼと同様です。より低いpHではタンパク質分解活性が大幅に低下します。これは、より低い pH 値が等電点と一致するためである可能性があります (pI、5.6 ± 0.2、図 4b)。 BrのKB76プロテアーゼ。 otitidis18 と緑膿菌株の角膜損傷プロテアーゼ 4 も同様の pI を持つことが他の研究者によって報告されています。 さらに、UcB5 プロテアーゼの pH 安定性は、pH 6 で安定していた緑膿菌の ZuhP13 プロテアーゼ 17 および緑膿菌 24 の ME4 プロテアーゼとは対照的に、エロモナス ベロニ PG0128 のプロテアーゼと同様に、60 分間 8 ～ 11 の間で見られました (図 4a)。 60分は-9。

調査した発色基質に対して、酵素はさまざまな程度のアミド分解活性を示しました (表 2)。 キモトリプシンおよびズブチリシンプロテアーゼの標準プロテアーゼ基質である N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA は、UcB5 によって最も分解された基質であり、28.9 μmol min-1 L-1 のアミド分解活性を示しました。 さらに、UcB5は、プラスミンプロテアーゼの標準基質である発色基質D-Val-Leu-Lys-pNA、およびトロンビンプロテアーゼの基質であるD-Phe-Pip-Arg-pNAを分解した。 しかし、この酵素は、カリクレイン プロテアーゼ タイプの発色基質である D-Val-Leu-Arg-pNA に対して最も低い活性を示しました。 これらの発見から、UcB5 は Arg-ペプチド結合よりも Lys-ペプチド結合をより容易に加水分解するため、UcB5 はサブチリシンまたはキモトリプシンに類似していると結論付けることができます。 興味深いことに、ズブチリシン UcB5 は、ズブチリシン FS33 プロテアーゼ 29 と同様に、D-Phe-Pip-Arg-pNA よりも効果的に D-Phe-Pip-Arg-pNA を攻撃し、他のズブチリシンとは区別されました。

基質 N-Succ-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA に対する UcB5 の動態値は次のとおりです。 Kmは0.16mM、Kcat/Kmは301mM-1S-1。 他のズブチリシンに関しては、緑膿菌由来の ZuhP13 は 4.62 × 107 M-1 S-1 の触媒効力を示し、Kcat は 1.27 S-117 でした。 プロテウス ミラビリス N17-12 の ZapA の Phe-Ser に対する触媒効力は 291 mM-1 S-1、Km は 13.6 μM、Kcat は 3.96 S-1 でしたが、Phe-Leu に対する触媒効力は 13 mM-1 でした。 S-1、Kmは2.3μM、Kcatは0.03S-130でした。

アミド分解活性に対するカチオンの影響を調べたところ、どのカチオンも酵素活性化因子ではありませんでした。 プロテアーゼ試薬の影響を考慮すると、2,2'-ビピリジン、DTT、o-フェナントロリン、β-メルカプトエタノール、および 2 つのメタロプロテアーゼ阻害剤 (EDTA および EGTA) は UcB5 の活性に影響を及ぼさないことがわかりました (表 2) ）。 さらに、メルカプチド形成剤 (PHMB および EAM) はタンパク質分解活性に影響を与えませんでした。 したがって、我々は、トリプトファン (インドール) 基とセリン (ヒドロキシ) 基が UcB5 の活性中心またはその近くに位置していると提案します。 我々の発見を総合すると、UcB5 は大腸菌 espP 毒性プロテアーゼと同様のセリン プロテアーゼに属していると考えられます 31。 文献を参照すると、毒性のセリンプロテアーゼは毒性のメタロプロテアーゼと比較してまれであることに気づきました。 後者のタイプは、Y. ruckeri19、P. mirabilis N17-1230、および緑膿菌のほぼすべての株の抽出物で発見されました24、25。

フィブリン、ゼラチン、ムチン、ヘモグロビン、フィブリノーゲン、エラスチン、コラーゲン、IgG、血清アルブミンに対する UcB5 の相対活性は、それぞれ 32.0、65.6、6.8、23.8、76.3、11.2、42.5、0.0、12.7%でした。 免疫グロブリン G 型の非タンパク質分解は、特定の不要な細胞を標的とする UcB5 と IgG から作られるキメラタンパク質の生産において有望である可能性があります。 酵素の抗凝固特性を評価したその後の実験では、血漿タンパク質に対するタンパク質分解作用がさらに検証されました（補足表S1）。 UcB5の存在下では、血液の凝固時間は81秒に延長され、酵素なしの場合の凝固時間の3.5倍に達した。 フィブリンとフィブリノーゲンを破壊する UcB5 の能力は、微生物のプロテアーゼが体内の細菌の移動を促進するという考えを裏付けています。 その結果、人体内の細菌感染症を治療するために、抗生物質単独ではなく、適切なプロテアーゼ阻害剤を抗生物質と併用することに私たちは賛成しています32。

補足表 S1 に記載されている in vitro 実験中、UcB5 は培養 HT29 細胞株の 63.8% の細胞死を示しました。 さらに、赤血球の溶血が 3.9 倍増加しました。 その結果、細胞と赤血球膜の崩壊は、UcB5 の作用様式の一段階であると考えられます。 これが起こると、酵素はヘモグロビンや他の重要な内部タンパク質と反応し始めました。 UcB5 のこの特徴は、解剖された動物の胸部と腹部の内腔で観察された出血の原因である可能性があります。 提示された UcB5 の溶血活性および出血活性は、腸炎ビブリオのプロテアーゼ A と一致します。 9323 および緑膿菌の ZuhP13 プロテアーゼ 17。

マウスに UcB5 を注射すると、肝細胞内で小胞形成 (V) が発生し、ヘテロクロマチン (Hc) の蓄積により核膜 (nm) が変形しました。 さらに、TEM により、肝細胞の細胞膜と粗面小胞体 (ER) が完全に消失していることが明らかになりました (図 5)。 ミトコンドリアの構成には損傷がないため、UcB5 によって引き起こされる細胞および核の溶解は、アポトーシスではなく壊死によるものである可能性があります (M)。 引用された病理学的プロテアーゼに関しては、Pseudoalteromonas sp. N10 プロテアーゼと V. vulnificus プロテアーゼは、それぞれ筋肉タンパク質の障害を引き起こし、深部の創傷壊死を示しました 33。 魚は、Y. ruckeri プロテアーゼにより重大な細胞損傷を受けました19。 一方、研究者らは、連鎖球菌のプロテアーゼが壊死性筋膜炎と宿主組織の細胞アポトーシスの両方を誘発することを実証した 34 。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文とその補足情報ファイルに含まれています。

ジエチルアミノエチル

ジメチルスルホキシド

1,4-ジチオスレイトール

アミノベンズアミジンエチルアセトイミデート

エチレンジアミン四酢酸

エチレングリコ四酢酸

免疫グロブリンクラスG

ルリア – ファーミングブロス

3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド試薬

ポリヘキサメチレンビグアナイド

等電点

フェニルメチルスルホニルフルオリド

P-ニトロアニリン

大豆トリプシン阻害剤

ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動

サルモネラ・シゲラ寒天培地

透過型電子顕微鏡

トシル-1-リジン クロロメチルケトン

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著者らは、イマーム・アブドゥルラフマン・ビン・ファイサル大学（IAU）/基礎応用科学研究センターのプロジェクト番号IF-2020-028-BASRCを通じてこの研究活動に資金を提供してくださったサウジアラビア教育省研究イノベーション局に感謝の意を表します。 (BASRC)。

イマーム・アブドゥルラフマン・ビン・ファイサル大学（IAU）理学部生物学部、私書箱1982年、ダンマーム、31441、サウジアラビア

エッサム・コットブ、ハイファ・A・アルカタニ、ハッサ・A・アルシュワイ、サキナ・M・アルガルディ、ハナン・アルマハシール

基礎および応用科学研究センター、イマーム・アブドゥルラフマン・ビン・ファイサル大学、私書箱 1982、ダンマーム、31441、サウジアラビア

エッサム・コットブ、ハッサー・A・アル・シュワイエ、サキナ・M・アルガルディ

カフレルシェイク大学理学部植物学微生物学科、カフレルシェイク、33516、エジプト

バヘル・A・エル・ノグミ

アル・アズハル大学商学部統計学部（女子支部）、私書箱 11751、カイロ、エジプト

アスマー・A・アーメッド

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EK は研究の計画と酵素学的研究を実施しました。 BAEは細菌の特性評価と生体内研究を実施した。 HAA は in vivo 研究に協力しました。 AAA は、データの把握を含む統計分析とソフトウェア作業を実行しました。 はぁぁぁ。 酵素学の研究に役立ちました。 SMA はサンプル収集とソフトウェア作業を支援しました。 HA は環境サンプリングと原稿の編集を手伝ってくれました。 著者全員が原稿の下書きに協力し、最終フォームを承認しました。

エッサム・コットブへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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Kotb、E.、El-Nogoumy、BA、Alqahtani、HA 他。 加熱不十分のハンバーガーから回収されたネズミチフス菌 UcB5 由来の推定上の細胞傷害性セリン プロテアーゼ。 Sci Rep 13、3926 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-29847-8

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受信日: 2022 年 9 月 19 日

受理日: 2023 年 2 月 10 日

公開日: 2023 年 3 月 9 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29847-8

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